Ifyakupangapanga ifyakupangapanga ifyakupangapanga ifyakupangapanga ifyakupangapanga ifyakupangapanga ifyakupangapanga ifyakupangapanga (TME), lelo ukufumyako fye ifinono, ubunte bwafiko tabwaishibikwa. Apa, twapitulwikemo mu filonda ne filonda fya T ukufuma ku filonda ne filonda fya balwashi abakwata ubulwele bwa kansa ya pa muulu (HGSC) ku kusokolola ifya kulya ifya muli ifi fiputulwa fyapusanapusana ifya TME. Ama ascites na maselo ya cilonda yalikwata ukupusana kwakulisha ukwa fya kulya. Ukulingana ne cilonda, amaselo ya T ayaingila mu cilonda yalifulisha nga nshi mu 1-methylniconamide (MNA). Nangu ca kutila umusango wa MNA mu maselo ya T walikulilako, ukusokolola kwa kwa N-methyl transferase (inshila iilenga amabumba ya methyl ukutamfiwa ukufuma ku S-ukuya ku maselo ya cilonda) kwapelela ku maselo ya fibumba na ku maselo ya cilonda. Mukubomba, MNA ilalenga amaselo ya T ukufumya ifilonda ifitungilila icilonda ica alpha. Eico, MNA iyafuma kuli TME ilaafwako ku kusunga ubucingo bwa maselo ya T kabili iimikilila ubucingo bwa mubili ubwalinga ubwa kundapa kansa ya muntu.
Ifintu ififuma ku filonda kuti fyakwata amaka ya kucingililako umubili ku filonda, kabili ubushininkisho ubwingi bulanga ukuti kuti fyabomba nga ca kutila ubulwele bwakula (1). Ukulunda pa fyo Warburg acitile, umulimo wa nomba line walitendeka ukulanga imibele ya fimenwa ifya cilonda no bucibusa bwa iko ne mibele ya cilonda iya cilonda (TME). Amasambililo pa misango ya nkumba na maselo ya T aya muntu yalanga ukuti ukubomfya kwa glutamine (2), ukubomfya kwa glutamine (3) no kwalula kwa shuga (4) kuti fyabomba ukwabula ukuilama pa mabumba ya maselo ayapusanapusana aya bucingo. Ifyakupangapanga ifingi muli iyi nshila filacilikila imibombele ya maselo ya T aya kulwisha ifilonda. Cashininkishiwa ukuti ukucingililwa kwa cipindami ca BH4 kuti kwaonaula ukufulilako kwa maselo ya T, kabili ukufulilako kwa BH4 mu mubili kuti kwalenga ubucingo bwa mubili ukucingililwa ku filonda ukupitila muli CD4 na CD8. Ukulundapo, ukucingililwa kwa mubili ukwa kucingililwa ku malwele kuti kwapusushiwa ukupitila mu kupeelwa kwa BH4 (5). Mu cilonda ca mubili ica mubili (IDH), ukufumya kwa mubili uwa mubili uwa mubili (R-2-HG) kulacingilila ukubomba kwa maselo ya T, ukufulilako no kubomba kwa maselo ya mubili (6). Mu nshita ya nomba line, calangishiwa ukuti umulopa, uwafuma mu kupanga umulopa, ulepangwa na maselo ayacingilila ayafuma ku myeloid, kabili ukutwala kwa maselo ya T ukwa mulopa kuti kwacilikila imibombele ya maselo ya T. Mu kundapa, ukufumyapo kwa methylglyoxal kuti kwacimfya imilimo ya maselo ya myeloid ayafuma ku myeloid (MDSC) no kucincimusha ukucingililwa kwa kuceeceeta mu misango ya nkumba (7). Aya amasambililo yonse pamo yashininkisha umulimo ukalamba uwa fimenwa ififuma ku TME mu kusunga imibombele ya maselo ya T ne milimo.
Ukukanabomba bwino ukwa maselo ya T kwalandwapo sana muli kansa ya ku mabele (8). Ici cicitika pa mulandu wa mibele ya fya kulya iyaba mu kukanakwata umupashi uwalinga no kukanakwata umulopa uwalinga (9), ifilenga ukuti umulopa wa shuga na tryptophan fibe ifyafumamo pamo nga asidi wa lactic na kynurenine. Ukucilapo ukubomfya umukaka wa pa nse ya maselo kulacefyako ukupanga umulopa uwa mubili (IFN-γ) kabili kulatungulula ukwaluka kwa mabumba ayanono aya mubili (10, 11). Ukubomfya kwa tryptophan kulacilikila ukufulilako kwa maselo ya T kabili kulacilikila ukufulilako kwa maselo ya T (12-14). Nangu ifi fyasangwa, umulimo uukalamba uwashinguluka ubucingililo bwa mubili bwacitilwe mu mibele ya maselo ya T aya vitro ukubomfya inshila iyalinga, nangu ukupelela ku misango ya nkumba iyapalana mu vivo, nangu cimo pali ifi tacilanga bwino bwino ubupusano bwa kansa ya muntu na ififulo ifikulu ifya mubili.
Icimonwa icaishibikwa ica kansa ya ku nsengo ni ukusansa kwa mu nkumbabulili no kumoneka kwa nkumbabulili. Ukulonganika kwa menshi ya maselo mu cifuba kulakumana no bulwele bwakulilako no kucenjela kwabipa (15). Ukulingana na malyashi, ici ciputulwa caibela tacakwata umupashi, cili ne fipimo fyakulisha ifya kulenga umubili ukukula (VEGF) ne fipimo fya mubili ifyalenga umubili ukukula (IDO), kabili cilasangwa mu maselo ya T ayatungulula umubili ne maselo ya kucingililamo umubili (15-18). Icifulo ca fyakulya ifya ascites kuti capusanako kuli cilya ica cilonda cene, eico ukubwekeshapo ukupanga ama cell ya T mu cifulo ca mubili takwaishibikwa bwino. Ukulundapo, ubupusano ubukulu no kukanalingana pakati ka ascites na ifintu ifisangwa mu cifulo ca filonda kuti fyacilinganya ukufika kwa maselo ya bucingo bwa mubili ne milimo yabo pa filonda, kabili ukufwailisha nakumbi kulafwaikwa.
Pa kuti tupwishe aya mafya, twapangile inshila ya kupaatulako amaselo ayatuntulu no kufwailishishamo amaselo ayapusanapusana (LC-MS/MS) pa kuti tusambilile imisango yalekanalekana iya maselo (ukusanshako amaselo ya CD4 + na CD8 + T) pamo pene na mu kati na pa kati ka filonda. Tubomfya iyi nshila pamo no kupiminako kwa misango iikalamba iya RNA (scRNA-seq) ku kupeela icikope icapwishishiwa ica mibele ya fyakulya ifya ifi fipendo ifikankaala. Iyi nshila yasokolwele ukulundako kwakulisha ukwa cipimo ca 1-methylniconamide (MNA) mu maselo ya T aya cilonda, kabili mu fyakwesha fya mu vitro fyalangile ukuti ubusuma bwa MNA pa mulimo wa maselo ya T tabwaishibikwe kale. Mucituntulu, iyi nshila ilasokolola imibombele ya fyakulya pakati ka fipuupu na maselo ayacingilila umubili, kabili ilapeela ukwishiba ukwaibela pa fyakulya ificingilila umubili, ifingabomba bwino ku kundapa kansa ya mubili iyashintilila pa maselo ya T.
Twabomfeshe ukufwailisha kwakulisha ukwa kupongomoka kwa mubili pa nshita imo ine ukupima ukupoka kwa shuga. ifishibilo fyalinga ifipusanako amaselo ya bucingo bwa mubili ne misango ya maselo ya cilonda (Itebulo S2 ne Cikope S1A). Uku kufwailisha kwalangile ukuti nga twacilinganya ku maselo ya T, amaselo ya ascites na ya tumor yalikwata imisango iikalamba iya kupoka umulopa wa shuga, lelo yalikwata ukulekanalekana ukunono mu milimo ya mubili. Ukufika ku cipimo ca glucose mu maselo ya cilonda [CD45-EpCAM (EpCAM)+] kuli imiku itatu ukufika kuli ine ukucila pa maselo ya T, kabili ukulingana kwa glucose ukwa maselo ya CD4 + T kuli imiku 1.2 ukucila pa maselo ya CD8 + T, icilanga ukuti amaselo ya CD8 + T yalikwata ifya kulya ifyapusanapusana. Mu kupusanako, umulimo wa fipimo fya mubili mu maselo ya cilonda walipalana ne wa maselo ya CD4 + T, kabili umulimo wa fipimo fya mubili uwa misango yonse ibili walicilapo ukucila uwa maselo ya CD8 + T (Icikope 1B). Mubwingi, ifi ifyasangwa filasokolola umusango wa fyakulya. Imilimo ya kupanga ifya kulya iya maselo ya cilonda yalikulilako ukucila iya maselo ya CD4 + T, kabili imilimo ya kupanga ifya kulya iya CD4 + T yalikulilako ukucila iya maselo ya CD8 + T. Nangu ifi ififumamo mu misango ya maselo, tapali ubupusano ubukonkana mu mibele ya fya kulya iya CD4 + na CD8 + T nelyo imilinganine yabo iyapalana mu ascites ukulingana ne fipuupu (Icilangililo 1C). Mu kupusanako, mu ciputulwa ca maselo ya CD45, umusango wa maselo ya EpCAM + mu cilonda walikulile ukulingana ne cilonda (Icikope 1D). Kabili twamwene ubupusano bwaumfwika ubwa kupanga ifya kulya pakati ka EpCAM + na EpCAM- ifiputulwa fya maselo. Amaselo ya EpCAM + (acilonda) yalikwata ukupoka kwa shuga ukwakulisha no mulimo wa mubili ukucila amaselo ya EpCAM-, ayo yalicilapo ukucila pa mulimo wa kupanga ifya kulya mu maselo ya cilonda mu TME (Icikope 1, E na F).
(A na B) Ubukulu bwa kufiita (MFI) ubwa kutwala umulopa (2-NBDG) (A) ne milimo ya mubili iya CD4 + T (MitoTracker iyafiita) (B) Amagrafu ya kwimininako (ku kulyo) na ifishinka fyatantikwa (Ku kulyo), ama CD8 + T na maselo ya EpCAM + CD45-. (C) Ubupiina bwa maselo ya CD4 + na CD8 + (aya maselo ya CD3 + T) mu filonda ne cilonda. (D) Ubukulu bwa EpCAM + amaselo ya cilonda mu cilonda ne cilonda (CD45-). (E na F) EpCAM + CD45-icilonda na EpCAM-CD45-ukupoka kwa shuga (2-NBDG) (E) ne milimo ya mishipa (MitoTracker iyafiita) (F) ifikope ifimininako (ku kulyo) ne fyebo fyatantikwa (Ku kulyo) Amabuula ya mubili ne filonda fya mubili. (G) Amagrafu ayaimikilila aya CD25, CD137 na PD1 ukulangilila ukupitila mu kupima kwa mubili. (H na I) CD25, CD137 na PD1 ukulanga pa CD4 + T maselo (H) na CD8 + T maselo (I). (J na K) Ukwabula ukwishiba, ukubukisha kwa pa kati (Tcm), umubomfi (Teff) no kwibukisha umubomfi (Tem) ukushintilila pa kulanga kwa CCR7 na CD45RO. Ifikope ifimininako (ku kulyo) ne fyebo fya mu citabo (ku kulyo) ifya maselo ya CD4 + T (J) na maselo ya CD8 + T (K) mu filonda ne filonda. Imitantikile ya P iyaishibikwa ukupitila mu kwesha kwa t ukwabikwa pamo (* P <0.05, ** P <0.01 na *** P <0.001). Umutande uleimininako abalwele abalingana (n = 6). FMO, ukumoneka kwa lubuuto ukufumyamo umo; MFI, ubukulu bwa lubuuto lwa pakati.
Ukufwailisha nakumbi kwasokolwele ubupusano bumbi ubukalamba pakati ka mibele ya maselo ya T ayapwishiwa sana. Ukucincimusha (Icilangililo 1, G ukufika kuli I) no kwibukisha kwa kucita (Icilangililo 1, J na K) mu fipuupu fyalicilapo ukucila pa fipuupu (umusango wa maselo ya CD3 + T). Mu nzila imo ine, ukupituluka mu mibele ya fimenwa ukupitila mu kulanga ifishibilo fya kucincimusha (CD25 na CD137) ne fishibilo fya kupwisha [amaprotini ya mfwa ya maselo ayapangwa 1 (PD1)] fyalangile ukuti nangu ca kuti imibele ya fya kulya iya ifi fipendo yalipusana (Icilangililo S1, B ukufika kuli E) , Lelo takwali ukulekanalekana kwacindamisha ukwa fya kulya ukwali ukwalinga pa kati ka cikope S1. F ukufika kuli I). Ifi fyasangilwe fyashininkishiwe ukupitila mu kubomfya inshila sha kusambililamo ifya mashini ku kupeela ifya kulya ifya misango ya maselo (21), ifyo fyasokolwele na kabili ukubapo kwa maselo ayengi aya mu bongobongo wa mafupa (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) mu cilonda ca mulwele (Icikope S2A ). Pa misango yonse iya maselo ayaishibikwa, iyi misango ya maselo ya myeloid yalangishe ukupoka kwa shuga ukwakulisha no mulimo wa mishipa (Icilangililo S2, B ukufika kuli G). Ifi fyasangwa filalanga ubupusano bwa maka ubwa fya kulya pakati ka misango ya maselo ayengi ayasangwa mu filonda ne filonda mu balwashi ba HGSC.
Ubwafya bukalamba mu kwishiba imibele ya TIL ni ukukabila kwa kupaatulako ifilangililo fya maselo ya T aya busaka bwalinga, ubusuma no bukulu ukufuma ku fipuupu. Amasambililo ya nomba line yalanga ukuti ukusalapula no kunonsha inshila sha kupangamo amabead ukulingana no kupiminako kwa mubili kuti kwalenga kwaba ukwaluka mu mibele ya mubili iya mubili (22-24). Pa kucimfya ubu bwafya, twalungike inshila ya kunonshamo amabead ku kupaatulako no kupaatulako TIL ukufuma ku kansa ya muntu iya ku nse ya cifuba iyaputulwa mu kupanga ilyo bacili balepitulukamo na LC-MS / MS (mona Ifibombelo ne Nshila; Icikope 2A). Pakuti twishibe ifyo iyi mibele yalenga ukuti ifintu fibe bwino pa kwaluka kwa fya kulya, twalinganishe ifya kulya ifya maselo ya T ayabomfiwa na bapeela ubumi busuma pa numa ya ciputulwa ca pa muulu ica kupaatukanya amabead na maselo ayashapaatulwe lelo ayashele pali ice. Uku kufwailisha kwa kusunga ubusuma kwasangile ukuti kuli ukumfwana kwakulisha pa kati ka ifi ifintu fibili (r = 0.77), kabili ukubwekeshapo kwa musango yo ukwa ibumba lya 86 ifya kulya fya mubili kuli no kubwelelamo kwakulisha (Icikope 2B). Eico, iyi inshila kuti yacita ukufwailisha kwalungama ukwa fya kulya mu maselo ayapita mu misango ya maselo, eico ukupeela icifulo ca kubalilapo icakulisha ica kusanga ifya kulya ifyalinga mu HGSC, eico ukulenga abantu ukumfwikisha bwino bwino ifya kulya ifya mubili mu maselo.
(A) Icikope ca cilangililo ica kunonsha kwa mipeto ya magineti. Ilyo bacili balepitulukamo na LC-MS/MS, ama cell yakapita mu milungu itatu iyakonkana iya kucincimusha kwa mipeto ya magnetic nelyo ukushala pa ice. (B) Ukukuma kwa musango wa kunonsha pa buvule bwa fya kulya ifipya. Ubukulu bwa mipikile itatu kuli cila musango wa kunonsha ± SE. Umushila wa fitulukila uleimininako ubucibusa bwa 1:1. Ukwampana kwa mukati ka fipimo (ICC) ukwa mipimine iyabwekeshiwapo iyalangishiwa mu cishibilo ca axis. NAD, umuti wa mubili uwakwata amaka ya kupanga umubili. (C) Icikope ca cilangililo ca mulimo wa kupituluka mu fya kulya fya mulwele. Ama ascites nelyo ifilonda filalonganikwa ukufuma ku balwashi no kusungwa mu cifulo ca kufimbilikisha. Iciputulwa icinono ica cilangililo cimo na cimo capitulwikwemo ukupitila mu kufwailisha kwa menshi, lintu ifilangililo fyashele fyapitile mu miku itatu iya kunonsha amaselo ya CD4+, CD8+ na CD45-. Ifi fiputulwa fya maselo fyalipitulwikwemo ukubomfya LC-MS / MS. (D) Mapu ya kupya iyalinga iya misango ya fimenwa. Icilangililo ca miti cimininako ukulonganika kwa Ward ukwa mipaka ya Euclidean pakati ka ifilangililo. (E) Ukufwailisha kwa fiputulwa ifikulu (PCA) ifya cilangililo ca mapu wa fya kulya, ukulanga ifilangililo fitatu ifya cilangililo cimo na cimo, ifilangililo ukufuma ku mulwele umo wine fyasuntinkanishiwa ku mulongo. (F) PCA ya mibele ya fya kulya iya cilangililo icabikwa pa mulwele (e kutila, ukubomfya ukubwekeshapo kwa ciputulwa); umusango wa cilangililo walicefiwa ne cibumba icakonkoloka. PC1, iciputulwa cikalamba 1; PC2, iciputulwa icikulu 2.
Pa numa, twabomfeshe iyi nshila ya kunonsha ku kupituluka mu fiputulwa fya CD4 +, CD8 + na CD45-amaselo mu fiputulwa fya kubalilapo ifya mfuko ne fipuupu fya balwashi 6 aba HGSC (Icilangililo 2C, Icilangililo S3A ne Tebulo S3 na S4). Icipimo ca bantu abafwaya ukufika kuli 2% ukufika kuli 70% ica cilangililo cikalamba ica maselo aya mweo, kabili umusango wa maselo ulapusana nga nshi pakati ka ba lwele. Pa numa ya kupaatulako imipeto, iciputulwa icakulisha ica kufwaya (CD4+, CD8+ nangu CD45-) cikwata ukucila pali 85% iya maselo yonse aya mweo mu cilangililo pa kati. Iyi nshila ya kunonsha ilatulenga ukupituluka mu fipendo fya maselo ukufuma ku fipimo fya fipimo fya muntu, ifyo ifishingacitika ukufuma ku filangililo ifikulu. Ukubomfya iyi nshita, twasangile ukuti l-kynurenine na adenosine, ifi fibili ifyaishibikwa bwino ifya kucingililwa ku malwele fyalikulilwe mu maselo ya cilonda T nelyo amaselo ya cilonda (Icilangililo S3, B na C). Eico, ifi fyasangwa filalanga ubufumacumi no bucindami bwa kupaatukana kwa maselo yesu no bufundi bwa kupima ubukulu bwa fimenwa pa kusanga ifintu ifikankala ifya mubili mu fipimo fya mulwele.
Ukufwailisha kwesu na kabili kwasokolwele ukulekanalekana kwa maka ukwa misango ya maselo mu kati na pa kati ka balwashi (Icikope 2D ne Cikope S4A). Mu kupalako, ukulingana na bambi abalwele, umulwele 70 alangishe imibele yapusanapusana iya fya kulya (Icikope 2E na Icikope S4B), ukulanga ukuti kuti kwaba ukukanalingana kwakulisha ukwa fya kulya pa kati ka balwashi. Calicindama ukwishiba ukuti ukulingana na balwashi bambi (amalita 1.2 ukufika kuli 2; Ibula S1), umutengo onse uwa filonda ifyalonganikwe mu mulwele 70 (80 ml) wali uwacepa. Ukukonkomesha kwa misango yalekanalekana iya balwashi mu nshita ya kufwailisha kwa fiputulwa ifikulu (ku ca kumwenako, ukubomfya ukufwailisha kwa fiputulwa fya kubwelulukilamo) kulangilila ukwaluka ukwakonkana pa kati ka misango ya maselo, kabili imisango ya maselo na / nelyo ififulo ifinono fyalonganikwa bwino bwino ukulingana ne mibele ya metabolite (Icikope 2F ). Ukufwailisha kwa fimenwa fimo fimo kwashininkishe ifi ififumamo no kusokolola ubupusano ubukalamba pakati ka misango ya maselo na ififulo ifinono. Calicindama ukwishiba ukuti ukulekanalekana ukwakulisha ukwamonwa ni MNA, iyo ilingi line ikwata amaka mu maselo ya CD45- na mu maselo ya CD4+ na CD8+ ayaingila mu cilonda (Icikope 3A). Ku maselo ya CD4 +, ici cicitika cimoneka sana, kabili MNA mu maselo ya CD8 + na yo ilamoneka ukukuma nga nshi ku cifulo. Lelo ici tacicindama, pantu abalwele fye batatu pali 6 e bengapimwa pa kuti bamone nga ca kuti bali ne cilonda ca CD8+. Ukulunda pali MNA, mu misango yalekanalekana iya maselo mu filonda ne filonda, ifintu fimbi ifya kulya ifishaishibikwa bwino mu TIL nafyo fyalipusana ifya bufumacumi (Ifikope S3 na S4). Eico, ifi ifishinka filanga ubusuma bwa fimenwa ifibomfya umubili ku kufwailisha na fimbi.
(A) Ifyalinga ifya MNA mu CD4 +, CD8 + na CD45- amaselo ukufuma ku filonda ne cilonda. Icilangililo ca kabokoshi cilanga umupaka wa pakati (umushilwa), umutande wa fiputulwa fibili (icipimo ca cibumba) no mushinku wa fishinka, ukufika ku miku 1.5 umutande wa fiputulwa fitatu (umusango wa cibumba). Nga fintu calondolwelwe mu Fipe fya Mulwele ne Nshila, bomfyeni umutengo wa limma uwa mulwele ku kwishiba umutengo wa P (* P <0.05 na ** P <0.01). (B) Icikope ca mibele ya MNA (60). Ifyakupangapanga ifya mubili: S-adenosil-1-umubili; SAH, S-umubili-1-umubili uwalinga; NA, umuti wa nikotini; MNA, 1-umuti wa ciko; 2-PY, 1-metili- 2-piridoni-5-karboksamidi; 4-PY, 1-umuti-4-u-muti-5-u-kaboksamidi; NR, umuti wa nikotina; NMN, umuti wa nikotina. Ama enzyme (ayabuuta): NNMT, umuti wa kulesha umubili ukubomba bwino; SIRT, ifipesha amano; NAMPT, ukutwala umulopa ku mubili; AOX1, umuti wa kupanga umubili uwa 1; NRK, umuti wa kupanga umubili uwa kupanga umubili; NMNAT, umuti wa nikotinami uwa kutwala umubili ku muntu umo umo; Pnp1, umuti wa purine uwa kupanga umubili. (C) t-SNE iya scRNA-seq iya filonda (ifyafiita) ne cilonda (ifyafiita; n = 3 abalwele). (D) Ukusokolola kwa NNMT mu fipendo fya maselo ifyapusanapusana ifyaishibikwa ukubomfya scRNA-seq. (E) Ukusokolola kwa NNMT na AOX1 mu SK-OV-3, impyo ya muntu iya mwana (HEK) 293T, amaselo ya T na maselo ya T ayaposhiwa na MNA. Amashiwi ayapekanishiwa yalangishiwa ukulingana na SK-OV-3. Icilangililo ca kulandapo na SEM cilangishiwa (n = 6 abapeela ubumi busuma). Imitantikile ya Ct iyacila pali 35 ilamonwa nga iyabula ukumonwa (UD). (F) Ukulanga kwa SLC22A1 na SLC22A2 mu SK-OV-3, HEK293T, amaselo ya T na maselo ya T ayaposhiwa na 8mM MNA. Amashiwi ayapekanishiwa yalangishiwa ukulingana na SK-OV-3. Icilangililo ca kulandapo na SEM cilangishiwa (n = 6 abapeela ubumi busuma). Imitantikile ya Ct iyacila pali 35 ilamonwa nga iyabula ukumonwa (UD). (G) Amaselo ya MNA ayasangwa mu maselo ya T ayapeelwa ayatuntulu ayabomfiwa pa numa ya maawala 72 aya kufyalwa na MNA. Icilangililo ca kulandapo na SEM cilangishiwa (n = 4 abapeela abatuntulu).
MNA ilapangwa ukupitila mu kutwala ibumba lya methyl ukufuma ku SAM ukuya ku NA) ukupitila mu kutwala ibumba lya methyl (NNMT; Icikope 3B). NNMT ilasangwa sana mu misango yalekanalekana iya kansa ya bantu kabili ilakumana no kusansalikwa, ukusansa no kusansalikwa (25-27). Pa kwishiba bwino intuntuko ya MNA mu maselo ya T mu TME, twabomfeshe scRNA-seq ku kulanga imibele ya NNMT mu misango ya maselo mu filonda ne filonda fya balwashi batatu aba HGSC (Itebulo S5). Ukufwailisha kwa maselo mupepi na 6,500 kwalangile ukuti mu fifulo fya filonda ne filonda, ukusokolola kwa NNMT kwali fye ku fipendo fya maselo ya filonda ne filonda (Icikope 3, C na D). Calicindama ukwishiba ukuti takwaba ukusokolola kwa NNMT ukwamoneka mu cipendo conse ica bantu icilanga PTPRC (CD45 +) (Icilangililo 3D na Icilangililo S5A), icilanga ukuti MNA iyasangwa mu cipimo ca fya kulya fya mubili yalibikwa mu maselo ya T. Ukusokolola kwa aldehyde oxidase 1 (AOX1) kwalula MNA mu 1-methyl-2-pyridone-5-karboksamide (2-PYR) nelyo 1-methyl-4-piridone-5-karboksamide (4-PYR); Icikope 3B) na kabili calikanishiwa ku cipendo ca fibumba ifilanga COL1A1 (Icikope S5A), ifyo pamo filanga ukuti ama cell ya T tayakwata amaka ya kupanga ifya kulya ifya MNA. Icilangililo ca ifi ifimenwa ifikuma ku MNA cashininkishiwe ukubomfya amashiwi ya bubili ayaibela aya maselo ukufuma ku balwashi ba HGSC (Icilangililo S5B; n = 6) (16). Ukulundapo, ukufwailisha kwa qPCR ukwa maselo ya T ayapeela ubumi ayaposhiwa na MNA kwalangile ukuti ukulingana ne maselo ya SK-OV-3 aya cilonda ca mu nkumbabulili, NNMT nelyo AOX1 mupepi no kukanasokolwelwa (Icilangililo 3E). Ifi ifyasangwa ifishicetekelweko filangilila ukuti MNA kuti yafumishiwa ukufuma ku fipimo fya fipimo nelyo ifipuupu mu maselo ya T ayapalamine mu TME.
Nangu ca kuti abafwaya ukubombako muli ulupwa lwa batwala ifya kulya ifya mweo 1 ukufika kuli 3 (OCT1, OCT2 na OCT3) abalembelwe ku lupwa lwa batwala ifya kulya 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 na SLC22A3), abatwala ifya kulya ifya MNA tabalondolwelwe (28). QPCR ya mRNA ukufuma ku maselo ya T aya bumi ayasuma yalangishe imilingo ya kulanga iyacepa iya SLC22A1 lelo imilingo ya SLC22A2 iyabula ukumonwa, iyo yashininkishe ukuti yalilandwapo kale mu fyalembwa (Icikope 3F) (29). Mu kupusanako, umutande wa maselo ya SK-OV-3 aya cilonda ca mu nkumbabulili walangile imilingo ya pa muulu iya batwala bonse babili (Icikope 3F).
Pa kwesha nga ca kuti ama cell ya T kuti yakwata amaka ya kunwa MNA iya ku calo cimbi, ama cell ya T aya bumi ayasuma yalikulilwe pa maawala 72 mu kubapo kwa misango yalekanalekana iya MNA. Nga takuli MNA iyafuma kunse, ifyaba mu maselo ya MNA tekuti fimoneke (Icikope 3G). Nangu cibe fyo, amaselo ya T ayabomfiwa ayaposhiwe na MNA iyafuma ku nse yalangishe ukulundako kwashintilila pa musango wa MNA mu maselo, ukufika kuli 6 mM MNA (Icikope 3G). Ici icasangwa cilanga ukuti nangula umulingo uunono uwa mimonekele ya batwala no kubulwa kwa enzyme iikalamba iyakwata umulimo wa kupanga ifya kulya ifya MNA mu maselo, TIL kuti yapoka MNA.
Imisango ya fimenwa mu maselo ya T aya mulwele na mu fyakwesha ifya kunwa ifya MNA mu vitro filakulisha amaka ya kuti amaselo ya kansa ayapalana na kansa (CAF) yafumya MNA na maselo ya cilonda kuti yatungulula imibele ne milimo ya TIL. Pa kwishiba ifyo MNA icita pa maselo ya T, amaselo ya T ayapeela ayatuntulu yalibomfiwe mu vitro mu kusangwa nelyo ukukanabapo kwa MNA, kabili ukufulilako kwabo no kupanga ama cytokine fyalipitulwikwemo. Pa numa ya nshiku 7 isha kulundako MNA pa cipimo cakulisha, impendwa ya bantu iyabili yalicefiweko panono, lintu amaka yasuminishiwe pa cipimo conse (Icikope 4A). Ukulundapo, ukuposha kwa MNA iya ku nse kwalengele ukufulilako kwa cipimo ca CD4 + na CD8 + T ifilanga ukuti ifilonda fyaonaika-α (TNFα; Icikope 4B). Mu kupusanako, ukupanga kwa mu kati ka maselo ukwa IFN-γ kwacefiwe nga nshi mu maselo ya CD4 + T, lelo te mu maselo ya CD8 + T, kabili takwali ukwaluka kwacindamisha mu maselo ya mubili (IL-2; Icikope 4, C na D). E ico, ukupima kwa mubili ukwabikwa pamo na ELISA ukwa fimenwa ifyafuma muli ifi fimenwa fya T ifyaposhiwa ne MNA kwalangile ukulundako kwakulisha ukwa TNFα, ukucepa kwa IFN-γ, kabili takwali ukwaluka mu IL-2 (Icilangililo 4, E ukufika ku G). . Ukucepa kwa IFN-γ kulangilila ukuti MNA kuti yabomba umulimo wa kucilikila imibombele ya maselo ya T aya kulwisha ifilonda. Pakuti twingapashanya ifyo MNA icita pa maselo ya T, amaselo ya T (FRα-CAR-T) ayakwata amaselo ya folate α na CAR-T (GFP) ayatungululwa na maselo ya mulopa ayatuntulu (GFP) -CAR-T) yapangwa na maselo ya mulopa ayatuntulu ayapeelwa umulopa. Amaselo ya CAR-T yalikulilwe pa maawala 24 mu kubapo kwa MNA, kabili lyene yalikulilwe pamo na maselo ya muntu aya SK-OV-3 aya cilonda ca mu cifuba ayalanga umupokelele wa folate α pa cipimo ca 10:1. Ukuposha kwa MNA kwalengele ukucepa kwakulisha ukwa mulimo wa kwipaya uwa maselo ya FRα-CAR-T, ayo yali ayapalana ne maselo ya FRα-CAR-T ayaposhiwe na adenosine (Icikope 4H).
(A) Ukupenda kwa maselo yonse ayasuma no kubilisha kwa cipendo ca bantu (PD) ukwabula ukupita mu mbali pa bushiku bwa 7. Icilangililo ca bar cimininako umutengo + SEM uwa bapeela ubumi busuma 6. Imininako amashiwi ukufuma ukufika kuli n = 3 ifyakwesha ifyaibeela. (B ukufika kuli D) CD3 / CD28 na IL-2 fyabomfiwe ku kulenga amaselo ya T ukubomba pa fipimo fyabo ifya MNA pa nshiku 7. Ilyo bacili balefwailisha, ama cell yalecincimushiwa ne PMA / ionomycin ne GolgiStop pa maawala 4. Ukulanga kwa TNFα (B) mu maselo ya T. Icakumwenako icikope (ku kulyo) na ifishinka ifyatantikwa (ku kulyo) ifya TNFα ukulangisha mu maselo aya mweo. IFN-γ (C) na IL-2 (D) ukumoneka mu maselo ya T. Ukusokolola kwa ma cytokine kwapimilwe ukupitila mu kupima kwa ma cytokine. Icilangililo ca mipeto cimininako umutande (n = 6 abapeela ubumi busuma) + SEM. Ukubomfya ukupitulukamo kwa nshila imo ukwa kwaluka no kupima ukwabwekeshiwapo (* P <0.05 na ** P <0.01) ku kwishiba umutengo wa P. Imininako amashiwi ukufuma ukufika kuli n = 3 ifyakwesha ifyaibeela. (E ukufika kuli G) CD3 / CD28 na IL-2 fyabomfiwe ku kulenga amaselo ya T ukubomba pa fipimo fyabo ifya MNA pa nshiku 7. Iciputulwa ca nshita calisontelwe ilyo ama-awala 4 aya kucincimusha aya PMA / ionomycin tailafika na pa numa. Ukusansa kwa TNFα (E), IFN-γ (F) na IL-2 (G) kwapimilwe na ELISA. Icilangililo ca mipeto cimininako umutande (n = 5 abapeela ubumi busuma) + SEM. P umutengo washininkishiwa ukubomfya ukupitulukamo kwa nshila imo ukwa kwaluka no kupima ukwabwekeshiwapo (* P <0.05). Umushila wa tudodo ulelanga umupaka wa kusanga uwa kusanga. (H) Ukupima kwa maselo. Amaselo ya FRα-CAR-T nangu GFP-CAR-T yalilungishiwe ne cilonda ca mubili (250 μM) nangu MNA (10 mM) pa maawala 24, nangu ukushala ukwabula ukuposhiwa (Ctrl). Iciputulwa ca kwipaya kwa maselo ya SK-OV-3 calipimilwe. P umutengo waishibikwa ukupitila mu kwesha kwa Welch t (* P <0.5 na ** P <0.01).
Pakuti mukwate ukwishiba kwa mibombele ya TNFα iyashintilila pa MNA, ukwaluka mu TNFα mRNA iya maselo ya T ayaposhiwa na MNA kwapitulwikwemo (Icilangililo 5A). Ama cell ya T aya bumi ayapeelwe ayapokelelwe na MNA yalangishe ukulundako kwa miku ibili mu fipimo fya kulemba ifya TNFα, ukulanga ukuti MNA yashintilila pa mafunde ya kulemba aya TNFα. Pa kufwailisha iyi nshila iyalinga iya kutungulula, ifintu fibili ifyaishibikwa ifya kulemba ifitungulula TNFα, e kutila, ukubomfya T cell nuclear (NFAT) na protein iyalinga 1 (Sp1), fyalipitulwikwemo mu kwasuka ukuminkanya kwa MNA ku mubomfi wa TNFα uwapalamisha ( 30 ). Umubomfi wa TNFα alikwata ififulo 6 ifyaishibikwa ifya NFAT ifya kufimbapo ne fifulo 2 ifya kufimbapo ifya Sp1, ukusankanishiwa pa ncende imo [-55 ifishinte fibili (bp) ukufuma ku 5'cap] (30). Ukucingililwa kwa mubili (ChIP) kwalangile ukuti ilyo kwaposhiwa na MNA, ukuminkanya kwa Sp1 ku TNFα kwakuliile imiku itatu. Ukubikwamo kwa NFAT na kabili kwakulileko no kupalamina ku bucindami bwa (Icikope 5B). Iyi data ilangisha ukuti MNA ilakonkanyapo ukusokolola kwa TNFα ukupitila mu kulemba kwa Sp1, kabili ukufika ku cipimo icinono ukusokolola kwa NFAT.
(A) Ukulingana na maselo ya T ayakulilwe ukwabula MNA, ukupilibuka kwa misango ya TNFα ukusokolola mu maselo ya T ayaposhiwa na MNA. Icilangililo ca kulandapo na SEM cilangishiwa (n = 5 abapeela abatuntulu). Imininako amashiwi ukufuma ukufika kuli n = 3 ifyakwesha ifyaibeela. (B) Umubomfi wa TNFα uwa maselo ya T ayaposhiwa nelyo ukwabula 8 mM MNA pa numa ya NFAT na Sp1 fyasangilwe pamo na (Ctrl) na PMA / ukucincimusha kwa PMA pa maawala 4. Iciputulwa ca mubili ica G (IgG) na H3 fyabomfiwe nga ifipimo ifibi ne fisuma ifya kucingilila umubili ku malwele, ukulingana. Ukupima kwa ChIP kwalangile ukuti ukuminkanya kwa Sp1 na NFAT ku TNFα umubomfi mu maselo ayaposhiwa MNA kwakulile imiku iingi ukulingana no kucenjela. Imininako amashiwi ukufuma ukufika kuli n = 3 ifyakwesha ifyaibeela. Umutengo wa P uwashininkishiwa ku fyakwesha ifingi ifya t (*** P <0.01). (C) Ukulingana ne filonda fya HGSC, amaselo ya T (ayashili ya cilonda) yalangishe ukulundako ukulanga kwa TNF mu cilonda. Amalangi yaleimininako abalwele abapusanapusana. Ama cell ayalangishiwa yasangilwe ukwabula ukusalapo ukufika kuli 300 kabili yasuntinkanishiwe ku kucefyako ukukopa ukucilapo (** Padj = 0.0076). (D) Icilangililo ca MNA icapeelwa kuli kansa ya ku mabele. MNA ilapangwa mu maselo ya cilonda na mu maselo ya filonda mu TME kabili ilasendwa na maselo ya T. MNA ilakulisha ukuminkanya kwa Sp1 ku TNFα umubomfi, ukutwala ku kulunduluka kwa TNFα ukulemba no kupanga kwa TNFα. MNA na kabili ilalenga ukucepa kwa IFN-γ. Ukukansha ukubomba kwa maselo ya T kuletwala ku kucefyako amaka ya kwipaya no kwangufyanya ukukula kwa cilonda.
Ukulingana na malyashi, TNFα ili na ku ntanshi na ku numa-ukushintilila pa kulwisha ifilonda no kulwisha ifilonda, lelo ili no mulimo uwaishibikwa bwino uwa kulenga ukukula no kusansalikwa kwa kansa ya ku nse ya cifuba (31-33). Ukulingana na malipoti, ukusansa kwa TNFα mu fipimo fya mubili ne fipimo fya mubili ifya cilonda mu balwashi abakwata kansa ya ku nse ya cifuba kwalicilapo ukucila mu fipimo fya mubili ifyabula ububi (34-36). Mu fyo ifintu fyaba, TNFα kuti yatungulula ukubomba, ukubomba no kufula kwa maselo ya mulopa ayabuuta, no kwalula umusango wa maselo ya kansa (37, 38). Ukulingana na ifi fyasangwa, ukufwailisha kwa misango yalekanalekana ukwa fimenwa kwalangile ukuti TNF yali iyalinga nga nshi mu maselo ya T mu fipimo fya filonda ukulingana na ascites (Icilangililo 5C). Ukuninina kwa TNF ukusokolola kwamoneke fye mu fipendo fya maselo ya T ayakwata umusango uushakwata ubukali (Icilangililo S5A). Mukufusha, ifi ifishinka filatungilila imimwene ya kuti MNA ili na fibili ifya kucingilila umubili ku malwele no kutungilila ifilonda mu HGSC.
Ukulemba kwa lubuuto ukwashintilila pa kupima kwa mubili ukwa mubili kwasanguka inshila iikalamba iya kusambililamo imibombele ya TIL. Aya masambililo yalanga ukuti ukulingana na maselo ya mulopa aya pa mbali nelyo amaselo ya T ukufuma ku fipimo fya mulopa ifya bubili, TIL ya murine na ya muntu yalikwata umusango ukalamba uwa kupoka umulopa wa shuga (4, 39) no kuonaula panono panono ukwa mulimo wa mulopa (19, 40). Nangu ca kuti twamona ifyafumamo ifyapalanako muli ili isambililo, ukutunguluka kwacindamisha ni ukulinganisha ukubomba kwa maselo ya cilonda na TIL ukufuma ku cilonda cimo cine icaputulwa. Ukulingana na fimo ifya muli aya mashiwi yapita, amaselo ya cilonda (CD45-EpCAM +) ukufuma ku filonda ne filonda yalikwata ukupoka kwa shuga ukucila pa maselo ya CD8 + na CD4 + T, ukusuminisha ukuti ukupoka kwa shuga ukwafulilako ukwa maselo ya cilonda kuti kwalinganishiwa ku maselo ya T. Icilangililo ca kucimfyanya kwa maselo ya T. TME. Lelo, imilimo ya maselo ya cilonda yalicilapo ukucila iya maselo ya CD8 + T, lelo imilimo ya maselo ya CD4 + T yalipalana ne ya maselo ya CD4 + T. Ifi fyasangwa filakosha umutwe uulefumapo uwa kuti ukubomfya kwa mubili ukwa mubili kwalicindama ku maselo ya cilonda (41, 42). Kabili batila amaselo ya CD8 + T kuti yacingililwa ku kukanabomba bwino ukucila amaselo ya CD4 + T, nelyo ukuti amaselo ya CD4 + T kuti yabomfya intuntuko sha kaboni ukucila pa shuga ku kusungilila imilimo ya mubili (43, 44). Ici cifwile ukwishibikwa ukuti tatwamwene ubupusano mu kusenda kwa shuga nelyo imilimo ya mishipa pa kati ka CD4 + T ifilenga, T ifilenga ukubuushiwa na T ukubuushiwa kwa pa kati mu filonda. Mu fyo fine, umusango wa kwaluka kwa maselo ya CD8 + T mu fipuupu taukwete ifya kucita ku kwaluka mu kusenda kwa shuga, ukulanga ubupusano ubukalamba pa kati ka maselo ya T ayakulilwe mu vitro na TIL ya muntu mu vivo (22). Iyi mimwene na kabili yashininkishiwe ukupitila mu kubomfya kwa kwakanya kwa maselo ukwabula ukusalulula, ukwasokolwele na kabili ukuti amaselo ya CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + ayakwata ukupoka kwa shuga ukwakulisha no mulimo wa mishipa ukucila amaselo ya tumor yalifulilako lelo yalikwata amaselo ayabomba aya Metabolic. Ici cipendo kuti caimininako icipendo icinono ica maselo ayacingilila umubili nangu amaselo ayacingilila umubili ayasangwa mu kufwailisha kwa scRNA-seq. Nangu ca kuti fyonse fibili ifi fyalandwapo mu fipuupu fya mu nkumbabulili ifya bantunse [45], na kabili filekabila Umulimo umbi uwa kulondolola ici ciputulwa ca myeloid.
Nangu cakuti inshila sha kupiminako umulopa kuti shalondolola ubupusano ubuli bonse mu fyakulya ifya shuga na ifyakupangapanga ifyakupangapanga pakati ka misango ya maselo, ifyakupangapanga ifyalungama ifipangwa na shuga nangu ififulo fimbi ifya carbon ifyakupangapanga ifyakulya mu TME tafyaishibikwe. Ukupeela ukubapo nangu ukukanabapo kwa fimenwa ifipya ku ciputulwa ca TIL cimo cifwaya ukusangulula umutengo wa maselo ukufuma ku fipimo fyafuminemo. Eico, inshila yesu iya kunonshamo amaselo ukubikwa pamo no kupima ubukulu bwa maselo kuti yapeela amano ku fyakupangapanga ifyapusanapusana mu maselo ya T na maselo ya tumor mu kulinganya ifilangililo fya mulwele. Nangu ca kuti iyi nshila ili na ifisuma ukucila ukusalulula kwa maselo ayabomfiwa ku kusansalikwa, amabuuku yamo aya fya kulya kuti yaonaika pa mulandu wa kushintilila kwa cifyalilwa na / nangu ukupilibuka kwa bwangu (22). Na lyo line, inshila yesu yali na maka ya kusanga ifintu fibili ifyaishibikwa ifya kucingilila umubili ku malwele, adenosine na kynurenine, pantu fyalipusana nga nshi pakati ka misango ya filangililo.
Ukufwailisha kwesu ukwa fya kulya ifya fipuupu ne misango ya TIL kulapeela amano ayengi pa mulimo wa fya kulya mu TME ya cifuba. Ica kubalilapo, ukubomfya ukupima kwa mubili, twasangile ukuti takwali ukupusana mu milimo ya mubili pa kati ka fipuupu na maselo ya CD4 + T. Nangu cibe fyo, ukufwailisha kwa LC-MS / MS kwasokolwele ukwaluka kwacindamisha mu buvule bwa fya kulya ifya mubili pa kati ka ifi fipendo, ukulanga ukuti ukufikilisha pa lwa fya kulya fya mubili ifya TIL ne milimo ya iko yonse iya fya kulya fya mubili kufwaya ukupilibula bwino bwino. Ica bubili, MNA e cintu icakwata ubupusano ubukulu pa kati ka maselo ya CD45 na maselo ya T mu filonda, te filonda. Eico, ukuputula ne ncende ya cilonda kuti fyakwata ifyapusana pa fyakulya fya TIL, ifilanga ubupusano ubungacitika mu cifulo icinono. Ica butatu, ukusokolola kwa MNA-ukupanga enzyme NNMT ukucila pali CAF, iyo ni maselo ya cilonda ukufika ku cipimo icinono, lelo imilingo ya MNA iyaishibikwa ilamonwa mu maselo ya T ayafuma ku cilonda. Ukucilapo ukulanga NNMT mu CAF ya cifuba kuli no kwishibikwa ukwa kulenga kansa ukukula, mu ciputulwa pa mulandu wa kucincimusha kwa CAF ukwa kupanga ifya kulya, ukusansa kwa filonda no kusansalikwa (27). Nangu ca kutila umusango onse uwa TIL walilinga, ukusokolola kwa NNMT mu CAF kwapalana sana no musango wa mu kati uwa kansa (TCGA), uuli no kukwata ubusuma bwa ku ntanshi (27, 46, 47). Mukulekelesha, ukusokolola kwa enzyme AOX1 iyakwata umulimo wa kuonaula MNA na kabili kwapelela ku cipendo ca CAF, icilanga ukuti ama cell ya T tayakwata amaka ya kwalula MNA. Ifi fyasangwa filatungilila umuntontonkanya wa kuti nangula umulimo umbi ulekabilwa ku kushininkisha ifi fyasangwa, imilingo iikalamba iya MNA mu maselo ya T kuti yalanga ukubapo kwa cifulo ca CAF ica kukansha ubulwele.
Ukupeelwa umusango uunono uwa mimonekele ya batwala ba MNA na imisango iishishibikwa iya ma protein ayacindama ayasangwa mu kwalula kwa MNA, ukubapo kwa MNA mu maselo ya T takwacetekelwa. Nangu NNMT nangu AOX1 tafyaishibikwe ukupitila mu kufwailisha kwa scRNA-seq no kufwaya qPCR iya mabumba yabili ayaibela. Ifi fyasangwa filangilila ukuti MNA tayapangwa na maselo ya T, lelo ilapokelelwa ukufuma ku TME iyashinguluka. Amakwebo ya mu vitro yalalanga ukuti ama cell ya T yalafwaya ukulonganika MNA iya kunse.
Amasambililo yesu aya mu vitro yalangisha ukuti MNA iya ku nse ilalenga ukusokolola kwa TNFα mu maselo ya T no kulundulula ukuminkanya kwa Sp1 ku TNFα umubomfi. Nangu ca kuti TNFα ili ne milimo yonse ibili iya kulwisha ifilonda no kulwisha ifilonda, muli kansa ya ku nse ya cifuba, TNFα kuti yalenga ukukula kwa kansa ya ku nse ya cifuba ukukula (31-33). Ukufumyapo kwa TNFα mu mibele ya filonda fya mu nkumbabulili nelyo ukufumyapo icishibilo ca TNFα mu misango ya nkumba kuti kwawamya ukupanga kwa cilonda ukwa TNFα no kucilikila ukukula kwa cilonda (32, 35). E ico, muli iyi milandu, MNA iyafuma ku TME kuti yabomba nga ca kutila umubili wa muntu ulebomba bwino ukupitila mu nshila ya TNFα ukupitila mu nshita ya kupanga umubili, eico ukutungilila ukucitikako no kusabankana kwa kansa ya ku nse ya cifuba (31). Ukushintilila pali ici, ukucingililwa kwa TNFα kulesambililwa nga ca kutila kuti kwaba umuti wa kundapila kansa ya ku nse ya cifuba (37, 48, 49). Ukulundapo, MNA ilaonaula ubukali bwa maselo ya CAR-T ku maselo ya cilonda ca mu cifuba, ukupeela ubushininkisho na bumbi ubwa kukansha kwa bucingo bwa mubili ukwa MNA. Mukulonganika, ifi ifyasangwa filangilila umusango umo ifilonda na maselo ya CAF yafumya MNA mu TME iya kunse ya maselo. Ukupitila mu (i) ukucincimusha kwa kukula kwa kansa ya ku nse ya cifuba ukwaletwa na TNF na (ii) ukukansha kwa mulimo wa maselo ya T ayaletwa na MNA, ici kuti cakwata ififumamo fibili ifya cilonda (Icilangililo 5D).
Mukulekelesha, ukubomfya ukusankanya kwa bwangu bwangu ukwa maselo, ukukonkana kwa maselo yamo no kupanga ifyakulya, ili isambililo lyasokolwele ubupusano ubukulu ubwa mubili pakati ka fipuupu na maselo ya ascites mu balwashi ba HGSC. Uku kufwailisha ukwafikapo kwalangile ukuti kwaliba ukupusana mu kukwata kwa shuga ne milimo ya mishipa pakati ka maselo ya T, kabili kwasangile MNA nga umubili uushakwata amaselo ayaibela aya kusunga umubili. Iyi data ili na maka pafyo TME ikuma imibombele ya maselo ya T muli kansa ya bantu. Nangu cakuti ukucimfyanya kwalungama ukwa fyakulya pakati ka maselo ya T na maselo ya kansa kwalandwapo, ifintu ifipya kuti fyabomba nga bakakonkanyapo abalungama ku kutungilila ukukula kwa cilonda kabili nalimo ukucingilila amasuko ya bucingo bwa mubili. Ubulondoloshi ubumbi ubwa mulimo wa ifi ifintu ifikonkanyapo kuti bwaisula inshila shimbi isha kuwamyako ubucingo bwa mubili ubwa kulwisha ifilonda.
Ifyakumwenako ifya mulwele ne fyebo fya ku cipatala fyasangilwe ukupitila mu cifulo ca kusungilamo ifipimo fya fipimo fya kansa ica BC icashininkishiwe na kabungwe ka fipimo fya fipimo fya ku Canada. Ukulingana na mafunde ayasuminishiwe na Komiti wa Mibele Isuma iya Kufwailisha pa Kansa uwa BC na Sukulu Likalamba ilya British Columbia (H07-00463), ifilangililo fyonse ifya balwashi ne fyebo fya ku cipatala fyapokelelwe ukusuminisha kwalembelwe ukwaishibikwa nelyo ukuleka ukusuminisha kwabo ukwalinga. Ifyakumwenako fyasuminishiwa mu citabo ca fipe fya mweo ifyashininkishiwa (BRC-00290). Imibele ya mulwele iyalungama ilangishiwa mu Fitabo S1 na S5. Pa kusunga ifintu mu cifulo ca kufimbilikisha, icipe ca kufimbapo cibomfiwa ku kuonaula icilonda ca mulwele no kucisuntinkanya ukupitila mu cipimo ca ma micron 100 pa kuti pabe umulopa umo uwa maselo. Icilonda ca mulwele calipooselwe pa 1500 rpm pa maminiti 10 pa 4°C ku kupanga ama cell no kufumyapo ifya pa muulu. Ama cell ayasangilwe ukufuma ku cilonda na ku filonda fyasungilwe mu 50% iya mulopa wa muntu uwabula ukutenta (Sigma-Aldrich), 40% iya RPMI-1640 (Iya sayansi iya bashilika) na 10% iya mulopa wa muntu uwabula ukutenta. Iyi imiputule ya maselo ayasungilwe yalisungululwe no kubomfiwa ku fyakupangapanga no kusanga ifyakupangapanga ifyalondolwelwe pe samba.
Iciputulwa cakumanina cikwata 0.22 μm iyasefiwa 50:50 iyalundwako RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Ifyakufwala ifyakufuuta) ifyalundwako na 10% umulopa wa muntu uwabula ukutenta (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Ifyakufwala ifyakufuuta), 2 mM l-glutamine (Ifyakufwala ifyakufuuta) Umuti wa cilonda (umuti wa cilonda) na 50 μMB-umuti wa cilonda. AimV (Ifyakupangapanga) fyalundwako na 20 mM Hepes (Ifyakupangapanga ifyakupangapanga) na 2 mM l-glutamine (Ifyakupangapanga ifyakupangapanga ifyakupangapanga). Icipimilo ca kufimbapo ica kufimbapo ica 0.22 μm ica kufimbapo ica kufimbapo (PBS; Invitrogen) icalundwako na 3% umulopa wa muntu uwa AB uwabula ukutenta (Sigma). Iciputulwa ca kucingililamo amaselo cipangilwe na 0.22 μm iya PBS iyasefiwa kabili iyalundwako na 0.5% iya mulopa wa muntu uwa AB uwabula ukutenta (Sigma-Aldrich).
Mu 37 ° C umupaka uwapwililika, ama cell yalibikwe na 10 nM MT DR na 100 μM 2-NBDG pa maminiti 30. Pa numa, ama cell yasuntinkanishiwe ne langi lya eF506 pa 4°C pa maminiti 15. Ukubweseshamo ama cell mu FC Block (eBioscience) na mu cipe ca kufimbapo amabala (BD Biosciences), ukubika mu cipe ca kufimbapo amabala (ukulingana na mafunde ya bapanga), no kufimba pa maminiti 10 pa muputule wa kufimbilikisha. Ukupaka ama cell ne fipe ifilwisha umubili (Itebulo S2) mu cipimo ca kupaka amabala pa 4°C pa maminiti 20. Ukubweseshamo ama cell mu cipe ca kufimbilikisha ica kufimbilikisha (Cytek Aurora; ukupanga kwa 3L-16V-14B-8R) ilyo bashilapitulukamo. Ukubomfya spectroflo na FlowJo V10 ku kupituluka mu fyebo fya kupenda ama cell, no kubomfya GraphPad Prism 8 ku kupanga ifyebo. Ukucila pa kati ka 2-NBDG na MT DR kwali ukwalinga, kabili lyene ukufwailisha kwa t ukwabili kwabomfiwe ku kupituluka mu fipendo ku kupenda abalwele abapalana. Fumyeni imitantikile yonse iya bantu iyakwata ifyacitike ifyacepako pali 40 ukufuma mu kufwailisha; ingisha umutengo wa MFI uwa 1 ku mitengo iili yonse iyabipa ilyo ushilacita ukufwailisha kwa fipendo no kumona ifyebo.
Pa kuti tufikilishe inshila ya kufimbilikisha iya kuboko iya pa muulu, twabomfeshe ukulondolola konse ukwa muti wa kukansha imimonekele (FAUST) (21) ku kupeela amaselo ku cipendo ca bantu pa numa ya kufumyapo amaselo ayafwa mu FlowJo. Tulatungulula ififumamo ku kusankanya ifipendo ifilemoneka ukuti tafyapeelwa bwino (ukubikako PD1+ na maselo ya PD1-tumor) no kusunga ifipendo. Cila cilangililo cili na maselo ukucila pali 2%, pa cipendo conse ica bantu 11.
Ukufuuta kwa fiko ukwafiita kwabomfiwe ku kupaatulako PBMC ukufuma ku fipe fya kupaatulako ifipimo fya mulopa (Ifyakupangapanga ifya STEMCELL). Ama cell ya CD8 + T yalipaatulwilwe ukufuma ku PBMC ukubomfya ifipe ifinono ifya CD8 no kulundululwa mu cipimo cakumanina ukubomfya TransAct (Iciputulwa ca Milimo) pa milungu 2 ukulingana na mafunde ya bapanga. Ama cell yasuminishiwe ukwiminina pa nshiku 5 mu cifulo cakumanina icakwata IL-7 (10 ng/ml; Pa bushiku bwalenga 7, ukulingana na mafunde ya bapanga ifipe, ifipe fya bantunse ifya CD45 (Miltenyi) fyabomfiwe ku kulenga amaselo ukukula mu miputule itatu iyakonkana. Ama cell yaputulwe ku kufwailisha kwa kupita kwa mubili (nga fintu calondolwelwe pa muulu), kabili amamilioni ya maselo yaputulwe imiku itatu ku kufwailisha kwa LC-MS / MS. Ifyakumwenako fyabomfiwe na LC-MS / MS nga fintu fyalondolwelwe pe samba. Twapimine umutengo wa fya kulya ifibulile ne mpendwa ya ion iya 1,000. Cila cilangililo cilalinganishiwa ne mpendwa yonse iya ion (TIC), iyapilibulwa mu cipimo kabili iyalinga iyaibela mu cipimo ca kufwailisha ilyo bashilapitulukamo.
Ukuimikwa kwa maselo umo umo ukwa mulwele umo umo kwafuminemo no kusefa ukupitila mu cisefa ca 40 μm mu cipimo cakumanina (nga fintu calondolwelwe pa muulu). Ukulingana na mafunde ya bapanga, imiku itatu iyakonkana iya kusalapo kwawama ukupitila mu kupaatukanya kwa fipe fya magnetic ukubomfya ifipe ifinono (Miltenyi) fyabomfiwe ku kunonsha ifilangililo fya maselo ya CD8+, CD4+ na CD45- (pa ice). Mukucefyako, ama cell yasuntinkanishiwa na kabili mu cipe cakufushishamo ama cell (nga fintu calondolwelwe pamulu) no kupendelwa. Ama cell yasuntinkanishiwe ne mipeto ya CD8 iya muntu, imipeto ya CD4 iya muntu nangu imipeto ya CD45 iya muntu (Miltenyi) pa 4°C pa maminiti 15, kabili lyene yasambilwe ne cipe ca kulenga ama cell ukukula. Icilangililo cipita mu cipimo ca LS (Miltenyi), kabili ifiputulwa ifisuma ne fibi filalonganikwa. Pa kucefyako inshita no kucilikila intanshi ya kubwesha amaselo, iciputulwa ca CD8 lyena cibomfiwa ku ciputulwa ca bubili ica CD4+ ukunonsha, kabili iciputulwa ca CD4 cibomfiwa ku kukonkapo ukunonsha CD45. Sunga umusango pali ice mu nshita yonse iya kupaatukana.
Pa kupekanya ifya kumwenako ifya kufwailisha ifya kulya, ama cell yasambilwe umuku umo no munyu uwatonta nga ice, kabili 1 ml iya 80% iya methanol yalilundilwe kuli cila cilangililo, lyena yasuntinkanishiwe no kufimba mu menshi ya nitrogen. Ifyakumwenako fyabikwe mu miku itatu iya kufiita-ukufuuta no kusansalikwa pa 14,000 rpm pa maminiti 15 pa 4°C. Iciputulwa ca pa muulu icakwata ifya kulya cilafuuka mpaka ciume. Ifyakupangapanga fyabwekeshiwemo mu 50 μl iya 0.03% iya asidi wa formic, ukusansalikwa ukusankanishiwa, elyo no kusansalikwa pakuti bafumye ifisoso.
Ukufumya ifimenwa nga fintu fyalondolwelwe pamulu. Ukutwala ifya pa mulu ku botolo lya menshi ayasuma aya kufwailisha pa fya mubili. Bomfyeni inshila ya kucitilamo ubundapishi bwa musango umo umo ku kuundapa cila cilangililo ne mpendwa iyapalana iya maselo pa kucingilila ififumamo fya batch. Twacitile ukupima kwalinga ukwa fya kulya fya mu calo conse ifyapulintwe kale pa citabo ca AB SCIEX QTRAP 5500 ica misango itatu iya misango ya misango (50). Ukufwailisha kwa misango ya misango no kusankanya kwa fifulo fya pa muulu fyacitilwe ukubomfya umusango wa 2.1 uwa programu (Ifyakubomfya ifya mweo ifya SCIEX).
Ukupenda kwa ion ukwa 1000 kwabomfiwe ku kupima umutengo wa fimenwa ifyabulile, kabili TIC iya cila cilangililo yabomfiwe ku kupenda icifulo ca pa muulu ica cila cimenwa icasangilwe ku kulungika ukwaluka ukwaletwa no kufwailisha kwa fibombelo ukufuma ku kubomfya kwa cilangililo. Pa numa ya TIC ukuwamya, umupitulushi wa fyakulya (51) (icipimo ca ntanshi) cibomfiwa ku kwalula kwa cipimo no kupima umutande wa cipimo icalinga. Twabomfeshe PCA ne cipe ca vegan R ku kucita ukufwailisha kwa kufwailisha ukwapusana kwa metabolome pakati ka misango ya cilangililo, kabili twabomfeshe ukufwailisha kwa ciputulwa ukwa kubwelulukila ku kufwailisha abalwele. Bomfyeni inshila ya Ward pakupanga mapu wa cimenwa pa kulonganika ubutali bwa Euclidean pakati ka ifilangililo. Twabomfeshe limma (52) pa bukulu bwa fimenwa ifyalinga pa kusanga ifimenwa ifingi ifyapusana mu musango onse uwa maselo na mu fifulo ifinono. Pa kuti ubulondoloshi bube ubwangu, tulabomfya umusango wa cipimo ca bumba pa kulanga umusango, no kutontonkanya pa misango ya maselo mu cifulo ca fipimo ifinono nga ibumba limo limo (n = amabumba 6); pa kwesha kwacindama, twacitile ukupima kwabwekeshiwapo ukutatu kuli cila cibumba Pa kuti twingacingililwa ku kubwelulushanya kwa bufi, umulwele alibikwemo nga cipumputu mu kupanga kwa limma. Pa kuti twishibe ifyapusana mu fya kupangapanga pa kati ka balwashi abapusanapusana, twalungike umusango wa limma ukubikako na balwashi mu nshila yashintililwapo. Tulelanda pa bucindami bwa kwampana ukwalumbulwa kale pakati ka musango wa maselo na ififulo ifinono ifya Padj <0.05 (ukulungika kwa Benjamini-Hochberg).
Pa numa ya kunonsha amaka ukubomfya Icipe ca Kufumyapo Amaselo Yafwa aya Miltenyi (> 80% ukufikapo), ukukonkana kwa maselo yamo ukwalembelwe kwacitilwe pa fipimo fyonse ifya filonda ifya mweo ne filonda ukubomfya 10x 5 'gene ukusokolola umusango. Imilandu isano iyapalana ne fipuupu ne fipuupu fyalipitulwikwemo, nangula ukucepa kwa bumi ukufuma ku cilangililo cimo ica fipuupu kwacingilile ukubikwamo kwa ciko. Pa kuti tufikilishe ukusalapo kwa balwashi abengi, twalonganike ifya kumwenako fya mulwele umo umo mu mishi ya 10x chromium ukukonkomesha, no kupituluka mu fifulo fya ascites ne filonda ukwapusana. Pa numa ya kukonkana [Ukukonkanyapo kwa 28×98 bp ukulekelesha kwabili (PE), umutundu wa muntu uwa Quebec; (53) (ukushintilila pa CellSNP nga SNP ya muntu iyaishibikwa (VCF) iyapeelwa kuli GRCh38 ipeelwa umusango wa mulwele uwapeelwa. (IBS), ukufumyamo amaselo ayashipeelwe na maselo ayaishibikwa nga ama duplex kabili ayapalana abapeela pa kati ka fipimo fya filonda ne filonda (54 Pa mulandu wa uyu mulimo, twasungile imilandu itatu iyakwata ukuimikilila kwa maselo ayengi mu cilonda ne filonda pa kuti ukupitulukamo mu nshila ya ku nse (Sc5o) 6975 (amaselo 2792 na 4183 ukufuma ku cilonda na ku filonda, ukulingana) ku kufwailisha. kabili ukumonwa na t-SNE.
PBMC yalipaatulwe ukufuma ku fyakupangapanga ifya kupaatulako amabuula ya mulopa (amatekinoloji ya STEMCELL) ukupitila mu kufimba kwa Ficoll. Ama cell ya CD3 + yalipaatulwilwe ukufuma ku PBMC ukubomfya ifipe fya CD3 (Imipeto). Mu kubapo nelyo ukukanabapo kwa MNA, amaselo ya CD3+ yalebomba na CD3 iyapamfiwa ku mbale (5 μg / ml), CD28 iyasunguluka (3 μg / ml) na IL-2 (300 U / ml; Proleukin). Pa bushiku bwa kulekelesha ubwa kukulilako, ukufikapo (Ukufikapo Ukwalinga ukwa Musambo wa Bumi) no kwaluka (Ukupenda amabuula 123, Sayansi ya Mulondo wa Mushili) fyapiminwe ukupitila mu kufwailisha kwa mubili. Ukupima umulimo wa bacipondoka ukupitila mu kucincimusha amaselo na PMA (20 ng / ml) na ionomycin (1 μg / ml) na GolgiStop pa maawala 4, no kuceeceeta CD8-PerCP (RPA-T8, Ilyashi lya pa Bumi), CD4-AF700 (Iciputulwa ca 11, BD). Ukucincimusha qPCR na ChIP amaselo na PMA (20 ng / ml) na ionomycin (1 μg / ml) pa maawala 4. Iciputulwa ca ELISA ica pa muulu calongene ilyo bacili balecibomfya kabili pa numa ya kucincimusha na PMA (20 ng / ml) na ionomycin (1 μg / ml) pa maawala 4.
Ukukonka amafunde ya bapanga pa kupaatulako RNA ukubomfya ifipe ifinono ifya RNeasy (QIAGEN). Ubomfye icakubomfya pakuti ifintu fibe ifyapalana. Bomfyeni RNA iya maka ukufika ku cipe ca cDNA (Icipe ca basambi ba fya sayansi) ku kupanga DNA iyalundwako (cDNA). Ubomfye TaqMan Rapid Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ku kupima ubukulu bwa misango ya fimenwa (ukulingana na mafunde ya bapanga) ne fipimo ifikonkelepo: 1010726-m1 (SLC22A2). Ifyakumwenako fyabomfiwe pa StepOnePlus inshita iine-ine iya PCR inshila (Ifyakubomfya Ifya Bumi) (Ifyakubomfya Ifya Bumi) mu cipe ca MicroAmp ica bwangu ica 96-icakubomfya (Ifyakubomfya Ifya Bumi) ne filimu iya MicroAmp iya kumona. Umutengo onse uwa Ct uwacila pali 35 umonwa ukuti uli pa muulu wa cipimo ca kusanga kabili ulembwa ukuti tausangwa.
Ukubomba ChIP nga fintu calondolwelwe kale (58). Mu kucefyako, ama cell yalebomfiwa ku kupanga umulopa (ukusansa kwa kulekelesha 1.42%) no kufimba pa muputule wa muputule pa maminiti 10. Ukubomfya umuti wa kufimba uwalundwako (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl na 0.1% NP-40) pa ice pa maminiti 10, lyene ukubweseshamo mu cipe ca kufimba nga fintu calondolwelwe (58 ). Icilangililo lyene calipooselwe ku mipepele ikonkelepo: imipepele 10 (imipepele 20 iya masekondi 1) ne nshita iyashintilila iya masekondi 40. Ukupanga umubili uwa musango wa ChIP (Ifyakupangapanga ifyakulangisha amaselo; 1μl), histone H3 (Ifyakupangapanga ifyakulangisha amaselo; 3μl), NFAT (Ifyakupangapanga ifyakupangapanga; 3μl) na SP1 (Ifyakupangapanga ifyakulangisha amaselo; Ukubika amaproteini A (Ifyakusambilila ifyakupangapanga) ne cilangililo pa 4°C no kukunkuma panono pa ora limo, lyena bomfyeni ifipe fya chelex (Bio-Rad) ukuwamya DNA, no kubomfya ifyakupangapanga K (Ifyakupangapanga ifyakupangapanga) ku kugaya ifyakulya. Umubomfi wa TNFα asangilwe ku PCR: ku ntanshi, ukutungilila kwa TNFα; mu kupusanako, 207-bp icipe ca 207-bp. Ifikope fyapangilwe na Lab ya fikope (Bio-Rad) no kupimwa ukubomfya programu wa ImageJ.
Iciputulwa ca misango ya maselo icafuminemo calongene nga fintu calondolwelwe pamulu. Ukufwailisha kwacitilwe ukulingana ne fyo abapanga ifipe fya kufwailisha ifya muntu ifya TNFα (Invitrogen), ifya kufwala fya muntu ifya IL-2 (Invitrogen) ne fya kufwala fya muntu ifya IFN-γ ifya kufwala (Abcam). Ukulingana na mafunde ya bapanga, umulopa wa pa muulu walibimbilwemo 1:100 ku kusanga TNFα na IL-2, kabili 1:3 ku kusanga IFN-γ. Ukubomfya ukumona 2104 ukubelenga ifishibilo ifingi (Ukubelenga) ukupima ukunwa pa 450 nm.
PBMC yalipaatulwe ukufuma ku fyakupangapanga ifya kupaatulako amabuula ya mulopa (amatekinoloji ya STEMCELL) ukupitila mu kufimba kwa Ficoll. Ama cell ya CD3 + yalipaatulwilwe ukufuma ku PBMC ukubomfya ifipe fya CD3 (Imipeto). Mu kubapo nelyo ukukanabapo kwa MNA, amaselo ya CD3+ yalebomba na CD3 iyapamfiwa ku mbale (5 μg / ml), CD28 iyasunguluka (3 μg / ml) na IL-2 (300 U / ml; Proleukin) pa nshiku 3. Pa numa ya nshiku 3, ama cell yasontelwe no kusamba na 0.9% umucele, kabili umupeto walibikwe mu cipe. Ukupenda kwa maselo kwacitilwe ukupitila mu kupima kwa maselo (Cytek Aurora; ukupanga kwa 3L-16V-14B-8R) ukubomfya amapenda 123 aya eBeads.
Ukufumya ifimenwa nga fintu fyalondolwelwe pamulu. Iciputulwa cauma capangilwe cipya cipya pa cipimo ca 4000 icalingana na maselo / μl. Ukupituluka mu cilangililo ukupitila mu kubwelulukila ku numa (1290 Ukwabula Intanshi II, Amano ya Agilent, Santa Clara, CA) na CORTECS T3 umulongo (2.1 × 150 mm, ubukulu bwa fipimfya 1.6-μm, ubukulu bwa fipimfya 120-Å; #186008500). Icipimilo ca misango ya misango (6470, Agilent), umo ukubomfya kwa malaiti kubomba mu nshila iisuma. Iciputulwa ca kusendama A ni 0.1% asidi wa formiki (mu H2O), iciputulwa ca kusendama B ni 90% asidi wa formiki, 0.1% asidi wa formiki. 100% A, 2 ukufika kuli 7.1 amaminiti 99% B, na 7.1 ukufika kuli 8 amaminiti 99% B. . Ukupita kwa menshi ni 0.4ml/min, kabili icumba ca milongo cilapya ukufika kuli 50°C. Ukubomfya umusango wa kemikali uwa busaka uwa MNA (M320995, Kampani ya kufwailisha iya kemikali iya ku Toronto) ku kupanga inshita ya kusunga (RT) no kwalula (RT = amaminiti 0.882, ukwalula 1 = 137 → 94.1, ukwalula 2 = 137 → 12 92). Ilyo ukupilibuka konse ukutatu kwacitika pa nshita iyalinga iya kusunga, ukupilibuka 1 kulabomfiwa ku kupima pa kushininkisha ubulungami. Icilangililo calinga ica MNA (Ikampani ya kufwailisha iya fya kemikali iya ku Toronto) capangilwe ukupitila mu kusanshamo kwa musango umo ukwa musango wa menshi (1 mg/ml) ku kusanga ifipimo fya 0.1, 1.0, 10 na 100 ng/ml na 1.0 na 10 μg/ml ukulingana na menshi. Ukufikapo kwa kusanga ni 1 ng / ml, kabili ukwasuka kwa mulongo kuli pa kati ka 10 ng / ml na 10 μg / ml. Cila nshita ya kupanga amamilita yabili aya cilangililo ne cipimo cibomfiwa ku kufwailisha kwa LC / MS, kabili icilangililo ca kuceeceeta ubusuma icasankanishiwa cilabomfiwa cila nshita 8 pa kushininkisha ukushintilila kwa cifulo ca kufwailisha. Amasuko ya MNA aya misango yonse iya maselo ayabomfiwa na MNA yali mu kati ka mulongo wa kwesha. Ukupitulukamo mu fyebo kwacitilwe ukubomfya ubupekanyo bwakupitulukamo mufishinka (v9.0, ubwafya).
Umutundu wa bubili uwa αFR-CAR ukupanga kwasendelwe ukufuma ku Nyimbo na bambi. (59). Mukucefyako, umusango uli na ifi ifikonkelepo: ukukonkana kwa ntungulushi ya CD8a, iciputulwa ca muntu ica αFR-icaibela ica musango umo uwapusanapusana, CD8a icifulo ca mu kati ka maselo, CD27 umuputule wa mu kati ka maselo na CD3z umuputule wa mu kati ka maselo. Ukukonkana kwa CAR ukwapwililika kwapangilwe na GenScript, elyo no kwalulwa mu nkulo ya bubili iya mimonekele ya lentiviral iya mu mulundu wa mimonekele ya GFP iyabomfiwe ku kupima ubusuma bwa kwalula.
Ici cikuko cipangwa ukupitila mu kusendama kwa maselo ya HEK293T [Ukulonganika kwa Mibele ya Musango wa ku America (ATCC); ukukulila mu cifulo ca Dulbecco ica kwalula ica Eagle icakwata 10% umulopa wa ng'ombe uuli mwi fumo (FBS) na 1% PenStrep, kabili cabomfeshe umulopa wa CAR-GFP na plasmids iya kupaka (pspax2 na pMD2.G, Addgene) ukubomfya umulopa wa ng'ombe (Sigma-Aldrich). Ici cimenwa icakwata ubulwele bwa virus calisontelwe pa numa ya maawala 48 na 72 panuma ya kusendwa, ukusefa, no kusankanishiwa ukupitila mu kusefa. Sungeni ifya kulya ifya misango misango pa -80°C ukufika ilyo fyapilibulwa.
PBMC yalipaatukana ukufuma ku fipe fya kupaatulako ifya bumi ubusuma (amatekinoloji ya STEM) ukupitila mu kusansalikwa kwa kufitulukila ukwa Ficoll. Ukubomfya ukusala bwino ukwa CD8 ukusalapo kwa CD8+ ukufuma ku PBMC. Ukucincimusha amaselo ya T ukubomfya TransAct (Ukubomfya) kabili mu TexMACS pa kati [Ukubomfya; ukulundapo na 3% umulopa wa muntu uushabomba no kukaba, 1% umulopa wa muntu uushabomba na IL-2 (300 U / ml)]. Ama-awala amakumi yabili na yane panuma ya kucincimusha, amaselo ya T yapilibulwa ne cikuko (10 μl iya cikuko icabikwa pa maselo 106). 1 ukufika kuli 3 inshiku panuma ya kupilibula pa Cytek Aurora (pa FSC (Ukusansalikwa ku Ntanshi) / SSC (Ukusansalikwa ku Lubali), Umo, GFP +), ukupima ukusokolola kwa GFP ukwa maselo ku kulanga ubusuma bwa kupilibula ukufika kuli 30% .
Ama cell ya CAR-T yalikulilwe pa maawala 24 mu cifulo ca kucingililamo umubili (amatekinoloji ya stemcell; ayalundwako na 1% PenStrep) mu mibele ikonkapo: ayashaposhiwa, ayaposhiwa na 250 μM adenosine nelyo 10 mM MNA. Pa numa ya kupanga, amaselo ya CAR-T yasambilwe na PBS no kusankanishiwa ne maselo ya SK-OV-3 20,000 [ATCC; mu cipimo ca McCoy 5A (Sigma-Aldrich) icalundwako na 10% FBS na 1% PenStrep pa 10: Umusango wa cipimo ca 1 walikulishiwe mu fiputulwa fitatu mu cipimo ca Immunocult icalundwako. Amaselo ya SK-OV-3 na maselo ya SK-OV-3 ayasanshiwe ne cipimo ca 0.5mg / ml; Pa numa ya maawala 24 aya kulima pamo, ifya kulya ifya pa muulu fyalongene kabili ifya kulya fya mu menshi fyalipimilwe ukulingana ne fyo abapanga ifipe balefwaya. Iciputulwa ca LDH icafuminemo calisansabikwe 1:50 mu cipe ca LDH. Iciputulwa ca kwipaya capimilwe ukubomfya inshila iyi: iciputulwa ca kwipaya = icipimo ca kulungika / icipimo ca kwipaya icakulisha x 100%, apo icipimo ca kulungika = amaselo ya T aya kupanga fye, kabili icipimo ca kwipaya = ukukonkomesha kwawama-ukukonkomesha ukwabipa.
Nga fintu calondolwelwe mu citabo nelyo ifipe ne nshila, bomfyeni ifitabo fya kupendapo ifya kupendapo. Nga cakuti ifyakumwenako ifingi fyalonganikwa ukufuma ku mulwele umo wine (nga ascites ne cilonda), tulabomfya ukufwailisha kwa t ukwabili nangu ukubikamo umulwele nge cakukonkapo mu cilangililo ca mulongo nangu icalinga nga fintu cifwile. Pa kufwailisha ifya kulya, ukufwailisha kwacindama kulacitwa mu fiputulwa fitatu.
Pa lwa fishinka fyalundwapo ifya muli ici cipande, mukwai moneni pa Intaneti.
Ici cipande caishibikwa icasalanganishiwa ukupitila mu mafunde ya Citupa ca Kupanga-Icabula Amakwebo, icasuminisha ukubomfya, ukusabankanya no kupanga cipya cipya mu nshila iili yonse, nga ca kuti ukubomfya kwa kulekelesha te kwa kusanga indalama kabili icishinka ca kuti umulimo wa kubalilapo walilungama. Kuloshako.
Ishiba: Tulemulomba fye ukulemba akeyala kenu aka email pakuti umuntu uo mulepandako amano kwi buula aishibe ukuti mulefwaya ukuti amone email kabili te spam. Tatukakwate amakeyala ya email ayali yonse.
Ici cipusho cibomfiwa ku kwesha nga uli mutandashi no kucingilila ukutuma kwa spam ukwaibela.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. (Raseli G. Jones), Fineasi T. Hamilton (Fineasi T.
MNA ilaafwako ukukansha ubucingo bwa maselo ya T kabili iimikilila ubucingo bwa mubili ubungabomfiwa ku kundapa kansa ya muntu.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. (Raseli G. Jones), Fineasi T. Hamilton (Fineasi T.
MNA ilaafwako ukukansha ubucingo bwa maselo ya T kabili iimikilila ubucingo bwa mubili ubungabomfiwa ku kundapa kansa ya muntu.
©2021 Ibumba lya ku America ilya Kutungulula Sayansi. insambu shonse shasuminishiwa. AAAS ni cibusa wa kwa Hinari, Agora, Oare, KORA, CLOCKSS, Ukukonkana no Kupenda. Ukutunguluka kwa Sayansi 2375-2548.