Ukusalapula kwa ma protein mu nshila ya kufimbilikisha kwalicindama ku kusungilila ukukansana kwa maselo no kusunga umubili. Ukulunda pa kusalulula ukupitila mu fipe, umulimo wa mafuta mu kusalulula kwa kinesin mu nshila ya kutwala ifya kufumamo ni cipusho ca nshita itali icishilasuka. Apa, tucita 3D pa nshita imo ine iya misango iingi iya misango iikalamba iya kupanga ifikope ifya nshita iine-ine ukushininkisha mu vivo ukuti amaproteini ayapya ayapangwa ayakwata amaproteini ayatali nga nshi aya ceramide yalibikwa pamo no kwakanishiwa mu fiputulwa fyaibela ifyapusanapusana ukufuma ku ncende ya kufumamo iya maproteini. Ukulundapo, tulalanga ukuti ubutali bwa nsuntinkanishisho ya ceramide mu ciputulwa ca nshita ica mubili bwalicindama kuli uku kusalapo kwa kusalapo. Isambililo lyesu lipeela ubushininkisho bwa kubalilapo ubwalungama mu vivo ubwa kwakanya ifipe fya ma protein ukulingana no butali bwa mipeto ya mafuta mu fifulo fyakutwala kunse mu nshila ya kufisama.
Mu maselo ya eukaryotic, amaproteini ayapangwa mu cipindami ca mubili (ER) lyena yasalanganishiwa ilyo yaletwala ukupitila mu nshila ya kufimbilikisha pa kuti yafikilwe ku maselo yabo ayalinga (1). Ukulunda pa kusalulula ukwa pa kati ka fyakufwala, calilangishiwe ukuti amafuta yamo kuti yabomba nga ififulo fyakufuminamo ifyasalapo ukupitila mu kuyalonganika mu fifulo fyaibela ifya maproteini ayaibela (2-5). Na lyo line, kucili ukubulisha ubushininkisho bwalungama ubwa vivo ubwa kushininkisha iyi inshila iyashintilila pa mafuta. Pakuti tupwishe ubu bwafya, twasambilile mu citutumusi ifyo amaproteini ayasuntinkanishiwa (GPI) yasuntinkanishiwa ukufuma ku ER. GPI-APs ni misango yalekanalekana iya mafuta ayasuntinkanishiwa ku maselo ya pa muulu ( 6, 7 ). GPI-AP ni protein iyafuminemo iyabikwa pa mapepala ya kunse aya cibumba ca plasma ukupitila mu ciputulwa ca mafuta (inkonkoni ya GPI). Basumina ifishinte fya GPI nga ukucingililwa pa numa ya kwalula mu ER lumen (8). Pa numa ya kufimba, GPI-AP ilapita mu cipe ca Golgi (5, 9) ukufuma ku ER ukufika ku cipe ca plasma. Ukusangwa kwa fishinte fya GPI kulenga GPI-AP ukusendwa ukwapusanako ukufuma ku fipimo fya mubili ifyafuma mu cifuba (ukubikako na fimbi ifya mubili ifyafuma mu cifuba) ukukonka inshila ya kufimbilikisha (5, 9, 10). Mu maselo ya citutumusi, GPI-APs yalipaatukana ukufuma ku maproteini yambi ayafumine mu cipe ca mu kati, kabili lyene yabikwa mu fipe fyaibela ifyafimbwa na maproteini ya coat II (COPII) (6, 7). Ifishinka ifilanga ukuti iyi nshila ya kwakanya mu nshila ya kutwala ku nse iya ER tafyaishibikwa bwino, lelo cimonwa ukuti iyi nshila kuti yafwaya amafuta, maka maka ukuwamya kwa mipangilwe ya ciputulwa ca mafuta ica GPI (5, 8). Mu citutumusi, ukuwamya kwa mafuta ya GPI kutendeka apo pene pa numa ya GPI ukuminkana, kabili mu milandu iingi, kulenga ceramide ukuminkana ku mafuta ya 26-carbon ayakwata umutande uutali (C26:0) (11, 12). C26 e cipimo cikalamba icapangwa na maselo ya citutumusi ukufika pali nomba. Ici cipangwa mu ER kabili ifingi fya fiko fitumwa ku cibombelo ca Golgi ukupitila mu fipe fya COPII (13). Ukutuma kwa ER ukwa GPI-AP mu kulungatika kufwaya ukukonkanyapo ukupanga ifya kulya (14, 15), kabili mu kupilibuka, ukupilibula ifya kulya ku fya kulya ifya kulya (IPC) mu cibombelo ca Golgi kushintikile pa kupanga ifya kulya ifya GPI (16). Amasambililo ya fya mweo ayakwata ifipe ifyapangwa yalangisha ukuti ifipe ifitali nga nshi ifya acyl kuti fyalongana pa kupanga ififulo ifyakonkana ifyakwata imibele ya fipe iyaibela (17, 18). Iyi data itwala ku cishinka ca kuti C26 na GPI-AP na C26 balabomfya imibele yabo iya ku mubili ku kulonganika mu fitungu ifisuma nelyo ifitungu mu cifulo ca mafuta aya ER ayaonaika. Ici cisanshamo sana ukuti ifintu ifinono kabili ifishakwata amafuta ayasuma (C16:1 na C18:1) (19, 20). Ifi fiputulwa fikasalapo ukubika amano ku fifulo fya kufumamo ifya ER (ERES), apo umushili na umushili uwashintilila pa GPI-AP kuti fyasendwa pamo ku Golgi mu ciputulwa cimo cine ica COPII icaipeelesha (5).
Muli ili isambililo, twaesha ukwabula ukupita mu mbali iyi nshila iyashintilila pa mafuta ukupitila mu kubomfya ifikope ifinono ifya nshita icine cine (SCLIM), iyo ni nshila iyalinga iya kufwailamo ifikope ifinono ifingamona pa nshita imo ine amaproteini ayalembelwepo amafuta. (21, 22).
Twabalilepo ukubomfya ubuteko bwa SCLIM ku kulundulula ifyo GPI-AP iyalinga ne bumba lya C26 lyapitulwikwemo ukufuma ku ma protein ayafumine mu cipindami panuma ya kufuma mu ER mu S. Pa kuti twishibe ifyapusanapusana ifya ER, twabomfeshe inshila ya cifyalilwa iyo kuti yamona bwino bwino ifipe ifipya ifyapangwa ifiingila mu ERES mu vivo (7, 23). Nga ifipe, twasalile C26 iyashintilila pa GPI-AP Gas1 iyalembelwepo na maprotini ayatuntulu (GFP) na maprotini ayatuntulu ayatuntulu aya Mid2 ayalembelwe na maprotini ayatuntulu ayatuntulu (iRFP), yonse yabili ayalungama ku cipindami ca plasma (24-26). Mu sec31-1 umusango uuumfwa ubukali, ifi ifipe fibili filalangishiwa pe samba lya umubomfi uulenga umulilo ukukula kabili ne cishibilo ca ERES. Pa nshita ya kupya nga nshi (37°C), pantu ukupilibuka kwa sec31-1 kulakuma umulimo wa ciputulwa ca kufwala ica COPII ica Sec31 ku kucilikila ukumena kwa COPII no kutuma ER ku nse, ifipe ifipya ifyapangwa filalonganika pa ER (23). Pa numa ya kutonta ukufika ku kukaba ukwacepa (24°C), amaselo ya sec31-1 ayapilibwilwe yabwelele ukufuma ku ncende ya kufimbilikisha, kabili ifipe ifipya ifyapangwa ifyalonganikwe fyatendeke ukutumwa ukufuma ku ER. Ukumona kwa CLIM kwalangile ukuti ifingi ifyapangwa nomba line ifya Gas1-GFP na Mid2-iRFP fyacili fyalonganika mu ER iya maselo ya sec31-1 ayapilibwilwe pa numa ya kufyalwa pa 37 ° C kabili lyene yafumine pa 24 ° C pa maminiti 5 (Icilangililo 1). Ukutula apo Mid2-iRFP yasalanganishiwa pa cipampa conse ica ER, kabili Gas1-GFP yasansalikwa no kulonganika mu cifulo ca cipampa ca ER icabula ukukonkana, ukusabankanya kwabo kwalipusanako nga nshi (Icilangililo 1, A ukufika kuli C na Filimu S1). Ukulundapo, nga fintu calangililwa mu cilangililo 1D, ibumba lya Gas1-GFP talyakwata Mid2-iRFP. Ifi fyasangwa filangilila ukuti GPI-AP na ma protein ayapita mu fipimo fyalipaatulwe mu fiputulwa fya fipimo fya ER ifyapusanapusana pa kutendeka. Iciputulwa ca Gas1-GFP cipalamina ku ERES iyaibela iyalembelwe ne cikope ca COPII ica mCherry (Icikope 1, E na F, na filimu S1) (23).
Ama cell ya sec31-1 yalalanga ifya kufumamo ifyafuma ku galactose, umutande wa acyl uwalepa (C26) uwa ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, umutuntula) na protein iya mu kati ka cibumba (TMP, iya buluu) kabili uku kulemba kwa ERES ukwakupanga Sec13-mCherry mu amaminiti, ukusendwa ku 24°C, no kupanga ifikope na SCLIM pa numa ya maminiti 5. (A ukufika kuli C) cilanga icikope icabikwa pamo nelyo icikope cimo ica 2D ica ndeke (A), icikope ca 2D ica fiputulwa 10 ifya z (B) nelyo icikope ca 3D ica fipe ne fishibilo fya ERES (C). Icipimilo ca 1μm (A na B). Icipimilo ca 0.551 μm (C). Gas1-GFP yasangilwe mu fitungu fya ER ifyapusanapusana nelyo ifilonganino, lintu Mid2-iRFP yasangilwe no kusabankanishiwa mu ciputulwa conse ica ER (C). (D) Icilangililo cilanga ubukata bwa kufitulukila ubwa Gas1-GFP na Mid2-iRFP mu cibumba ca Gas1-GFP ukukonka umutande wa mipeto iyabuuta (ku kulyo). AU, iciputulwa icakufwaya. (E na F) fimininako icikope ca 3D icasankanya ifipe ne cishibilo ca ERES. Amabumba ya Gas1-GFP yasangilwe mupepi na ERES iyalinga. Icipimilo ca 0.551 μm. (F) Umupeto uwakosa uwabuuta ulelanga ibumba lya Gas1-GFP ilyapalana na ERES. Amapanelo ya pakati na ku kulyo yalalanga icikope ca 3D icakulishiwa icabikwa pamo no kumona ukwapilibulwa ukwa cibumba ca Gas1-GFP icasalilwe.
Ubuza bwapalamisha ubwa mu ncende pakati ka cibumba ca Gas1-GFP na ERES iyalinga bulalanga ukuti Gas1-GFP kuti yaingila mu ERES iyasalapo, iyo iyapusanako ukufuma ku kusalapo ukwabomfiwa na Mid2-iRFP ukufuma mu ER. Pa kupwisha uku kucitikako, twapimine umusango wa ERES ku cipe fye cimo nelyo fibili (Icikope 2, A ukufika kuli C). Twasangile ukuti ama ERES ayengi (70%) yalikwata fye umusango umo uwa mipeto. Icikope ca panshi ica cilangililo 2C cilanga ifya kumwenako fibili ifyalinga ifya ERES ne Gas1-GFP fye (Icikope 1) nelyo fye Mid2-iRFP (Icikope 2). Mukupusanako, mupepi na 20% iya ERES ili na ifipe fibili ifisankanishiwe mu cifulo cimo cine. Casangilwe ukuti ama ERES yamo (10%) yali ne misango ibili iya mipeto, lelo yalipaatulwe mu fifulo fyapusana ifyaumfwika bwino. E ico, uku kupituluka mu fipendo kulangilila ukuti pa numa ya ER ukutumwa ku nse, GPI-AP Gas1-GFP ne fipe fya ku nse ifya Mid2-iRFP fyalipaatukana mu ERES shapusanapusana (Icikope 2D). Uku kusalulula bwino bwino kulakonkana nga nshi no kufwailisha kwa pa kale ukwa fya mweo (6) no kufwailisha kwa mipangilwe (7). Kabili kuti twamona imibele ya fipe fyabikwa mu cifungo ifiingila mu ERES (Icikope 2E na Filimu S2). Icikope 2E cilanga ukuti fye iciputulwa icinono ica Gas1-GFP (iciputulwa 3) nangu Mid2-iRFP (iciputulwa 4) cilaingila mu ERES ukufuma ku lubali lumo kabili cibikwa mu cifulo icapusana. Iciputulwa 5 ica cilangililo 2E cilanga ukuti Gas1-GFP na Mid2-iRFP inshita shimo fisangwa mu ERES imo ine, lelo fiingila ukufuma ku mbali shapusanapusana kabili fisangwa mu fifulo fyapusanapusana ifingaimika ifipe fyapusanapusana ifya COPII. Kabili twashininkishe ukuti ukulekanalekana kwamoneke no kwakanya kwa C26 ukwashintilila pa GPI-AP Gas1 nga ukusalapo kwa ERES kwaliba ukwalinga pantu umutolo umbi uwa ku nse, umusebo umbi uwa GFP uwalembelwepo umulopa Axl2 (27 ), ukulanga imibele iyapalana na Mid2-iRFP. (Icikope S1 na Filimu S3). Icipya icapangwa Axl2-GFP cilasalanganishiwa ukupitila mu cipe ca ER nga Mid2-iRFP (Icilangililo S1, A na B), kabili cisangwa pamo na Mid2-iRFP mu ERES ishingi (Icilangililo S1, B ukufika kuli D). Iciputulwa 1 na 2 ica cilangililo 1. S1C cilanga ifya kumwenako fibili ifyalinga ifya ERES apo ifipe fibili ifya ku nse ya cifuba fyasankana. Mu milandu iyi, ifipe fyonse fibili filaingila mu ERES pamo (Icikope S1E, Iciputulwa 3 na Filimu S3).
Pa numa ya kufimba pa 37 Pa numa ya kufimba pa maminiti 30 °C ukucingilila, ne cikope na SCLIM panuma ya maminiti 20. (A ukufika kuli C) Ifikope fya 2D ifyakulangisha (A; umutande wa cipimo, 1μm) nangu ifikope fya 3D ifyakupiminako (B na C; icipimo cakupiminako, 0.456μm) ifya mipeto na ifiputulwa 10 ifya z ifyalembwa na ERES. Iciputulwa ca panshi mu (B) ne ciputulwa mu (C) cilanga ifikope ifyapangwa ku kulanga fye ifipe ifili mu ERES (umutuntulu) [umulilo wa mfula (umutuntulu) na Mid2-iRFP (umutuntulu)]. (C) Umupeto uwaisuka: ERES itwala fye iciputulwa cimo ica mipeto (1 ukufika kuli 4). Umukonko wa fitulukila: ERES ili na ifipe ifyapusanapusana (5). Umufwi uwakosa uwabuuta: ERES iyakwata ifipe ifyabikwa pamo. Pa nshi: ERES imo iyasalilwe ili fye na Gas1-GFP (1) nelyo Mid2-iRFP (2). Icipimilo, 100 nm. (D) Ukupima ubukulu bwa cikope icalondolwelwe mu (C). Iciputulwa ca ERES icakwata fye umutolo umo (Gas1-GFP nangu Mid2-iRFP), umutolo uwapusanapusana ne mutolo uwabikwa pamo. Mukwesha kwaibela ukwatatu, n=432 mu maselo 54. Umutande wa filubo = SD. Ukufwailisha kwa t ukwabula imicila ibili. *** P = 0,0002. (E) Icikope ca 3D ica ERES iyasalilwe iya fipe fyabikwa pa mbali ifyalembelwepo (C). Ici cilalenga ukuti kube umulilo ukufuma ku lubali lumo kabili cilashintililwapo fye ku cifulo icinono mu kati ka ERES. Inshita shimo, imisango yonse ibili iya mipeto yaingila mu ERES imo ine (5) ukufuma ku lubali lumo kabili ilabikwa fye mu cifulo icaibela mukati ka ERES. Icipimilo, 100 nm.
Pa numa, twaesha ukutontonkanya ukuti umutande wa acyl uwalepa (C26) uulipo mu cipe ca ER uletungulula ukulonganika no kusalapo kwa Gas1 mu ERES iyasalapo. Pa kupwisha ici, twabomfeshe umusango wa citutumusi uwapilibulwa GhLag1, umo ifimenwa fibili ifya mu kati ifya Lag1 na Lac1 fyalyalwilwe na GhLag1 (umusango wa Lag1 uwa buto), icalengele umusango wa citutumusi uwakwata umusango wa citutumusi uwacepa ukucila umusango wa mpanga (Icikope 3A) (2). Ukufwailisha kwa misango ya fimenwa (MS) kwalangile ukuti mu misango ya fimenwa ifya mu mpanga, 95% iya fimenwa fyonse fyalitali nga nshi (C26) ifimenwa fya mulongo, lintu mu GhLag1, 85% ifya fimenwa fyalitali nga nshi (C18 na C16). ), fye 2% iya cimuti ca mushili icalepa nga nshi (C26) umushili wa cishilano. Nangu ca kutila C18 na C16 e fipe ifikulu ifyasangwa mu cipe ca GhLag1 ukufika pali nomba, ukufwailisha kwa MS na kabili kwashininkishe ukuti umukonko wa GPI uwa Gas1-GFP uwalangishiwa mu musango wa GhLag1 uli ne fipe fya C26, ifipaleneko ne fya musango wa mafuta. Ubusuma bwaba fye bumo bwine (Icikope 3A) (26). E ico, ici cipilibula ukuti umuti wa kupanga cipya cipya uwa Cwh43 ulasalapo nga nshi ku kupanga umubili wa C26, nga fintu cilangishiwa mu cilangililo 26, cilafwaya ukubikamo umukonko wa GPI ukufuma ku cipimo icinono ica mubili wa C26 mu musango wa GhLag1. S2 (29) Nangu cibe fyo, umubili wa maselo uwa GhLag1 uli fye na C18-C16, lintu Gas1-GFP icili na C26. Ici cishinka cilenga uyu musango wa cibombelo icisuma ica kupwisha ubwafya bwa butali bwa mulongo wa acyl uwa ceramide mu ER. Umulimo wa kutontonkanyapo uwa kalasi no kusalapo. Lyena, twabalilepo ukusambilila pa maka ya C26 Gas1-GFP ukulonganika mu filonganino mu GhLag1 ne cipimo ca kucincimusha ica kucincimusha ica sec31-1 ukupitila mu kufwailisha kwa cifyalilwa ukwa kufwailisha kwa cifyalilwa, uko fye umutande wa nshita itali (C18-C16) ulipo mu ER umuputule wa cipimo (Icikope 3). Twamwene ukuti mu ciputulwa ca 31-1, ifingi ifya Gas1-GFP fyalibikwe mu fibumba, lintu Gas1-GFP mu ciputulwa ca 31-1 GhLag1 ne ciputulwa ca ER icalepa (C18-C16) icalepa ica ceramide ica ER tacali icalonganikwa kabili icasalanganishiwa mu Mu ciputulwa conse ica ER. Pa kuba uwalungama, pa mulandu wa kuti ukulonganika kwa C26 ukwashintilila pa ceramide kwapalana sana na ERES iyalinga (Icikope 1), twakonkelepo ukufwailisha nga ca kuti iyi nshila kuti yasanshamo umulimo wa ER ukutuma amaproteini ku nse. GPI-AP ilabomfya inshila iyaibela iya COPII iya kutuma ER kunse, iyo iyatungululwa bwino bwino na Ted1 's ukuwamya kwa mipangilwe ya ciputulwa ca glycan ica nkonkoni ya GPI (30, 31). Iciputulwa ca GPI-glycan icabikwa pamo lyena ciishibikwa na ifipe ifipokelela ifipe ifya p24, ifyo mu kwangufyanya fisalapo ukubomba Lst1, icintu icalinga ica fipe ifikulu ifya COPII ifibikwa pamo Sec24, ukupanga ifipe ifikwata GPI-AP ifyakwata ifipe ifingi ifya COPII ififwaikwa (331). E ico, twapangile umusango wabili uwa kwalula uwasangwike ukufumyapo kwa ifi fimenwa fimo (iciputulwa ca p24 icakosa ica Emp24, GPI-glycan ukuwamya kwa enzyme Ted1 na ciputulwa ca COPII icaibela ica Lst1) pamo no musango wa kwaluka kwa sec31-1, kabili twafisambilile Bushe kuti cacitika ukupanga GFP1-c3). Twamwene ukuti mu ciputulwa ca 31-1 emp24Δ na mu ciputulwa ca 31-1Δ, Gas1-GFP mu cituntulu tayasangwa kabili yasalanganina mu ciputulwa conse ica ER, nga fintu twamwene kale mu ciputulwa ca 31-1 GhLag1, lintu mu ciputulwa ca 31-111, Gas1-GFP Nga sec3. Ifi fyasangwa filangilila ukuti ukulunda pa kubapo kwa C26 mu cipe ca ER, ukulonganika kwa Gas1-GFP na ko kufwaya ukuminkanya ku cipe ca p24, kabili takufwaya ukubomba kwa Lst1 ukwalinga. Lyena, twafwailishe nga cakutila ubutali bwa nsuntinkanishisho ya ceramide mu cipe ca ER kuti bwakonkanyapo ukuminkanya kwa Gas1-GFP ku p24. Lelo, twasangile ukuti ukubapo kwa C18-C16 mu cipe tacikuma GPI-glycans iyapangwa cipya cipya ku p24 (Ifikope S3 na S4, A na B) nelyo ukuminkanya ku GPI-AP no kutuma GPI-AP ku nse. maka. Ukubomfya umusango wa COPII uwa Lst1 (Icikope S4C). Eico, ukulonganika kwa C26 ukwashintilila pa ceramide takufwaya ukulanshanya kwa ma protein na imisango yalekanalekana iya ER iya kutwalamo ama protein, lelo kulatungilila inshila imbi iya kusalululamo iyatungululwa no butali bwa mafuta. Lyena, twapitulwikemo nga ca kuti ubutali bwa nsuntinkanishisho ya acyl mu ciputulwa ca ER bwalicindama ku kwakanya bwino ukwa Gas1-GFP nga ERES iyasalapo. Ukutula apo Gas1 mu musango wa GhLag1 uwakwata umusambo uunono uwa ER no kwingila mu cipe ca plasma (Icilangililo S5), twasumina ukuti nga ca kuti ukusalapula kwatungulwilwa no butali bwa musambo wa acyl, Gas1 mu musango wa GhLag1 kuti wapilibulwa no kwabuka. Ifipe fya ERES ifyakwata umubili umo wine.
(A) Iciputulwa ca maselo ica GhLag1 cikalamba cikwata amacepa ayapiipi aya C18-C16, lintu umupeto wa GPI uwa Gas1-GFP ucili na C26 IPC imo ine nga maselo ya musango wa mpanga. Pamulu: ukupituluka mu butali bwa mishipa ya acyl iya cimuti ca mubili ica musango wa mu mpanga (Wt) na imisango ya GhLag1p ukupitila mu kupima ubukulu bwa cimuti (MS). Amashiwi yamininako amapesenti ya ceramide yonse. Ubutantiko bwa fyakwesha fitatu ifyaibeela. Umutande wa filubo = SD. Ukufwailisha kwa t ukwabula imicila ibili. **** P <0,0001. Iciputulwa ca panshi: Ukupitulukamo kwa MS ukwa butali bwa nsuntinkanishisho ya acyl iya IPC iyasangwa mu Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI inkonto iyalangishiwa mu musango wa mpanga na GhLag1p imisango. Amashiwi yamininako amapesenti ya cishibilo ca IPC conse. Pakati ka fyakwesha fisano ifyaibeela. Umutande wa filubo = SD. Ukufwailisha kwa t ukwabula imicila ibili. ns, te cacindama. P = 0,9134. (B) Ifikope ifinono ifya 31-1, 31-1 GhLag1, 31-1emp24Δ, 31-1emp24Δ na 31-11Δ na 31-11Δ amaselo ayalanga umusango wa Gas1-GFP uwaletwa na galactose yalibikwe mu cifungo ukufika ku maminiti 37°C no kufimba pa maminiti 30 pa numa ya 24°C. Umufwi uwabuuta: Icilonganino ca ER Umupashi1-GFP. Umukonko uwaisuka: Gas1-GFP iyabula ukulonganika ilasalanganishiwa pa cipampa conse ica ER, ukulanga imibele ya ER iya kufwala kwa nyukiliya. Umupiminako, 5μm. (C) Ukupima ubukulu bwa cikope icalondolwelwe muli (B). Iciputulwa ca maselo ayakwata imipangile ya Gas1-GFP. Mukwesha kwaibela ukwatatu, amaselo n≥300. Umutande wa filubo = SD. Ukufwailisha kwa t ukwabula imicila ibili. **** P <0,0001.
Pa kupwisha ubu bwafya, twacitile ukumona kwa SCLIM ukwa Gas1-GFP na Mid2-iRFP mu GhLag1 na sec31-1 iya kwalula umulilo (Icilangililo 4 na Filimu S4). Pa numa ya ER ukusungwa pa 37 ° C kabili pa numa ukufumikwa pa 24 ° C, ifingi ifya Gas1-GFP ifyapangwa nomba line tafyalonganikwe no kusabankanishiwa mu ciputulwa conse ica ER, nga fintu camonwa ku fipe fya kumona ifinono ifya lyonse (Icikope 4, A na B ). Ukulundapo, impendwa iikalamba iya ERES (67%) yasanshamo imisango ibili iya mipeto iyabikwa pamo muli yene (Icikope 4D). Amabuula 1 na 2 aya cilangililo 4C yalalanga ifya kumwenako fibili ifya ERES ifyapalana na Gas1-GFP na Mid2-GFP. Ukulundapo, ifipe fyonse fibili fyalembelwe mu ERES imo ine (Icikope 4E, icikope 3 na filimu S4). Eico, ifyasangwamo fyesu filalanga ukuti ubutali bwa nsuntinkanishisho ya ceramide acyl mu cipe ca ER e cishinka cacindama ica ER ukulonganika no kwakanya.
Ama cell ya GhLag1 ayalanga ifya kufumamo ifyafuma ku galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, umutuntulu) na Mid2-iRFP (TMP, buluu) na ifiputulwa fya ERES ifyalembelwepo Sec13-mCherry (ERES, magenta) Ukubikwa pa 37°C. Twalilileni pa maminiti 30, pongoleni ukufika kuli 24°C pa kuti mufumye ifya kufumamo, kabili cikope na SCLIM pa numa ya maminiti 20. (A ukufika kuli C) Ifikope fyakulangisha ifya 2D (A; umutande wa cipimo, 1μm) nangu ifikope fya 3D ifyakupiminako (B na C; icipimo cakupiminako, 0.45μm) ifya fiputulwa 10 ifya z ifyalembwa ne mipeto na ERES. Iciputulwa ca panshi mu (B) ne ciputulwa mu (C) cilanga ifikope ifyapangwa ku kulanga fye ifipe ifili mu ERES (umutuntulu) [umulilo wa mfula (umutuntulu) na Mid2-iRFP (umutuntulu)]. (C) Umupeto uwaisulamo uwabuuta: ERES, ifipe fyalisansana. Icipe icaisulwa: ERES ili fye ne cintu cimo. Iciputulwa ca panshi: ERES iyasalilwe ili ne fipe ifyalinga (1 na 2) ifyalembelwe mu (C). Icipimilo, 100 nm. (D) Ukupima ubukulu bwa cikope icalondolwelwe mu (C). Mu fiputulwa fya 31-1 na 31-1, umutolo umo fye (Gas1-GFP nangu Mid2-iRFP) e wabikwamo, kabili impendwa ya pa kati iya ERES iya mitolo iyapusanapusana ne mitolo iyasankana. Mu fyakwesha fitatu ifyaibela, n = 432 mu maselo 54 (iciputulwa 31-1) na n = 430 mu maselo 47 (iciputulwa 31-1 GhLag1). Umutande wa filubo = SD. Ukufwailisha kwa t ukwabula imicila ibili. *** P = 0,0002 (iciputulwa 31-1) na ** P = 0,0031 (iciputulwa 31-1). (E) Icikope ca 3D ica ERES iyasalilwe ne mipeto iyasansalikwa (3) iyalembelwe mu (C). Gas1-GFP (iya katapa-katapa) na Mid2-iRFP (iya buluu) fyapalamina ku ERES (ifya buuta) ukufuma ku lubali lumo no kwikala mu cifulo cimo cine ica ERES icakanishiwa. Icipimilo, 100 nm.
Iyi isambililo lipela ubushininkisho bwalungama ubwa kuti amaproteini ayashintilila pa mafuta yasontwa mu fifulo fyakutwala kunse mu nshila ya kufisama, kabili ilasokolola ubucindami bwa butali bwa nsuntinkanishisho ya acyl ku kusalapo kwa misango. Ukubomfya inshila ya maka iya kufwailamo ifintu ifinono iyaitwa SCLIM, twalangile Gas1-GFP iyapangwa nomba line (iciputulwa cikalamba ica plasma ica GPI-AP icakwata umutande wa acyl uwalepa nga nshi (C26) iciputulwa ca mafuta ica ceramide) mu citutumusi iciputulwa ca ER (Icikope 1). Ukulundapo, iyi misango ibili iya fipe ilaingila mu ERES iyapusanapusana ukusalapo (Icikope 2). Ubutali bwa nsuntinkanishisho ya acyl iya cipindami bwacefiwa ukufuma ku C26 ukufika kuli C18-C16, icilonganino ca Gas1-GFP cilaonaika mu citungu ca ER icapusana, kabili Gas1-GFP yapilibulwa ukufuma mu ER ne cipindami ca muputule ukupitila mu ERES imo ine (Icilangililo 3 na Icikope 3). 4).
Nangu cakuti GPI-AP ilabomfya inshila iyaibela iya maproteini ukufuma muli ER, twasangile ukuti ukwaluka kwa C26 ukwashintilila pa ceramide takushintilila pa mibombele ya maproteini iyapusana iyo ingatwala ku ERES iyaibela (Ifikope S4 na S5). Mucifulo ca ifyo, ifyo twasanga filatungilila inshila imbi iya kwakanishishamo iyatungululwa na ma protein ayashintilila pa mafuta no kufumyapo ifipe fimbi. Ifyo twamona filangilila ukuti iciputulwa ca Gas1-GFP nelyo ibumba ilyapalana na ERES iyalinga talyakwata ifya kulya ifyafuma mu cifuba ifya Mid2-iRFP, ifilanga ukuti icilonganino ca GPI-AP icashintilila pa C26 cikalenga ukwingila kwabo mu ERES iyalinga, kabili pali ilya ine nshita, ukufumyamo ici cibumba icalinga ( 2). Mu kupusanako, ukubapo kwa C18-C16 mu cipe ca ER tacilenga GPI-AP ukupanga ifitungu nelyo ifibumba, eico tafifumyapo nelyo ukubika mu cifulo ca maprotini ayafuma mu cipe mu ERES imo ine (Ifikope 3 na 4). . Eico, tulesosa ukuti C26 ceramide ilatungulula ukwakanya no kwakanya ukupitila mu kwafwilisha ukulonganika kwa ma protein ayasuntinkanishiwa ku ERES iyalinga.
Bushe kuti mwafikilisha shani uku kulonganika ukwashintilila pa C26 mu cifulo cimo ica ER? Ukutemwa kwa cibumba ukwa kupaatukana mu mbali kuti kwalenga GPI-AP na C26 ukupanga amafuta ayanono kabili ayatantikwa bwangu bwangu mu cifulo ca mafuta ayashili ayalinga aya cibumba ca ER icakwata amafuta ayapiipi kabili ayashakwata amafuta. Amabumba ya mibele isuma (17, 18). Aya mabumba ayanono aya nshita iinono kuti yakonkanyapo ukusangwa mu mabumba yakalamba, ayashintilila panuma ya kwikatana ku p24 (34). Ukulingana na ici, twalangile ukuti C26 Gas1-GFP ilekabila ukubomba ne p24 iyakosa pa kupanga amabumba yakalamba ayamoneka (Icikope 3). Iciputulwa ca p24 ni ciputulwa ca p24 icakwata amaproteini yane ayapusanapusana aya p24 mu citungu (35), icipeela ukuminkanya kwa misango iingi, uko kuti kwalenga ukuminkanya kwa filonganino ifinono ifya GPI-AP, eico ukupanga icilonganino icikulu icashintililwapo (34). Ukulanshanya pakati ka fiputulwa fya ma protein ifya GPI-APs kuti kwalenga na kabili ukulonganika kwabo, nga fintu cilangishiwa mu nshita ya kutwala kwabo ukwa Golgi mu maselo ya nama ayapusanapusana (36). Nangu cibe fyo, ilyo umubili wa C18-C16 ulipo mu cipe ca ER, ilyo umubili wa p24 uleumfwana na Gas1-GFP, amabumba yakalamba ayapusanapusana tayakapangwe. Inshila iyacilapo kuti yashintilila pa mibele ya fibumbwa na kemikali iya ceramide iya mulongo wa acyl uwalepa. Amasambililo ya fya mweo aya fipe fyapangwa yalalanga ukuti nangu cakuti fyonse fibili ifitali (C24) ne fipi (C18-C16) ifipimo fya mipeto kuti fyalenga ukulekanalekana kwa fiputulwa, ifipimo fye ifitali ifya mipeto (C24) kuti fyalenga ukukosa kwakulisha no kukunkuma kwa filimu pa kupanga cipya cipya filimu. Ukupitila mu kulanshanya (17, 37, 38). Calangishiwa ukuti umuputule wa pa nshi uwa TMED2, umusango wa muntu uwa Emp24, ulasalapo ukubomba na C18 umuputule wa pa nshi uwashintilila pa nshishi mu fipindami fya mubili (39). Ukubomfya ukulinganisha kwa mibele ya molekyulu (MD), twasangile ukuti fyonse fibili C18 na C26 ifipe fya kulonganika ukushinguluka ifipe fya mubili ifya Emp24, kabili fyalikwata ifyo batemwa ifyapalanako (Icilangililo S6). Calicindama ukwishiba ukuti ici cilanga ukuti umuputule wa Emp24 kuti walenga ukusalanganya kwa mafuta mu cipindami ukukanalingana. Ici cisangwa nombaline icashintilila pa maselo ya nama. Ukupashanya kwapalana ukwa MD na ko kulalanga ukubapo kwa mafuta ya ether (40) . E ico, tuletontonkanya ukuti umulopa wa C26 mu fiputulwa fibili ifya ER26 walifulilako mu ncende. Ilyo GPI-AP mu fipimfya fya luminal ilakumanina ku p24 iyapusanapusana no kulonganika kwa C26 ukushinguluka p24 mu fipimfya fya mubili, kuti yatungilila ukulonganika kwa maproteini ayakonkana no kukunkuma kwa fipimfya fyapangwa ukupitila mu minwe (41), ukulenga GPI-AP ukukunkuma na kabili ukupaatukana mu fiputulwa ifikulu ifya ES. ifiputulwa fya muputule wa ER (42). Amalyashi yapita yasuminishe inshila yasontelwe (43, 44). Ukubikwa pamo ukwa misango yalekanalekana iya fimenwa ifinono, ifilenga ubulwele nelyo ifilwilo fya mubili ku fimenwa ifituntulu (GSL) pa cipe ca plasma cilenga ukulonganika kwa GSL ukwakulisha, ukukosha ukulekanalekana kwa fiputulwa no kulenga icipe ukukanaonaika no kwingila mu kati (44). Iwabuchi na fimbi.
Mu maselo ya nama ayapusanapusana, ukulonganya kwa muputule wa ku nse uwa Golgi (TGN) ukufika ku cipimo ca muputule wa pa muulu uwa plasma kulakonkanyapo ukupaatukana no kusalulula kwa GPI-AP (10, 45). Uku kulonganika kulatungululwa na GPI-AP ukuwamya (36), lelo kuti kwashintilila pa butali bwa nsuntinkanishisho ya ceramide iyo tusanga mu citutumusi. Nangu ca kutila GPI-AP iya nama ilikwata umukonko wa mafuta ya ether, kabili imipangile ya iko iya kemikali yalipusana nga nshi ukufuma ku ceramide uwalepa nga nshi, ukufwailisha kwa nomba line kwasangile ukuti amafuta yonse yabili yalikwata imibele ya ku mubili iyapalana ne milimo (40). Eico, iciputulwa ca mafuta ya ether mu maselo ya nama kuti capalana ne C26 mu citungu, kabili umulimo wa ciko wa kukumanya ne citungu ica nshita itali mu cipe ku kutungilila ukulonganika kwa GPI-AP no kusalulula. Nangu cakuti ici kuti cacitika cicili cilekabila ukuyeshiwa, ifyasangwa kale filatungilila ukuti ukutwala umutande wa acyl uwalepa ku mubili wa Golgi takucitwa na ma protein ayatwala umubili, lelo cishintilila pa kupanga ifishinte fya GPI nga umututu. Eico, inshila ya kusungilamo iya kwaluka ilamoneka ukuba iya maka ukusalapo ukutwala pamo umutande wa acyl uwalepa nga nshi na GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) mu cipe cimo cine ica kutwala.
Mu citutumusi na mu fimenwa ifyakwata amabumba ya maselo, ukulonganika kwa GPI-AP no kupaatukana ukufuma ku ma protein yambi aya mu plasma fyonse filacitika ilyo tafifikile pa muulu wa maselo. Paladino na bambi. (48) asangile ukuti pa TGN iya maselo ya nama ayapusanapusana, ukulonganika kwa GPI-AP takukabilwa fye ku kusalapo kwa GPI-APs ku ciputulwa ca plasma ica pa muulu, lelo na kabili kulakonkanyapo ukulonganika kwa GPI-APs ne milimo ya iko iya bumi. Pamulu wa maselo. Mu citutumusi, ili isambililo lyalangile ukuti ibumba lya GPI-AP ilyashintilila pa C26 pa ER kuti lyatungulula ubuteko bwa cibumba ne milimo ya GPI-AP pa cibumba ca plasma (24, 49). Ukulingana na iyi mibele, amaselo ya GhLag1 tayakwata ubulwele bwa GPI nelyo imiti ikola iyakuma ubufumacumi bwa cibumba ca maselo (28), kabili ukukabila kwa mabumba ya Gas1-GFP ayabomba (49) aya ceramide ya ku nsongo ayalangishiwa mu kuupa kwa maselo ya citutumusi yalanga G Amaselo ya hLa aya kuti yacitika. Icilubo ca GPI-AP. Na lyo line, ukufwailisha nakumbi nga cakuti ubutungulushi bwa mibombele ya pa muulu wa maselo bwapangwa ukufuma ku ER ukupitila mu nshila ya kusalululamo ukulingana no butali bwa mafuta kukaba umutwe wa kufwailisha kwesu ukwa ku ntanshi.
Imisango ya fimenwa ifibomfiwa muli uyu mulimo yatantikwa pa Ibula S1. Imisango ya MMY1583 na MMY1635 iya SCLIM iya kupanga ifikope fya maselo aya mweo yapangilwe ku numa ya W303. Iyi misango iyalanga Sec13-mCherry ne cishibilo ca maproteini ayatuntulu yapangilwe ukubomfya inshila iyashintilila pa kwasuka kwa misango ya misango (PCR) ne plasmid ya pFA6a nge cilangililo (23). Umusango uulelanga Mid2-iRFP uwalembwa na mapulotini ayatuntulu ayatungululwa na kalemba wa GAL1 wapangilwe ngefi. Ukukulisha kwa PCR ukwa iRFP-KanMx ukukonkana ukufuma ku pKTiRFP-KAN vector (ubupe bwa kwa E. O'Shea, nambala ya plasmid iyalundwako 64687; Pa numa ya kuti ukukonkana kwa fimenwa fya mu kati ka Mid2-iRFP kwakulishiwe no kupanga mu cipimo ca GAL1, kwabikwe mu cifulo ca I-Sac I ica kubikwamo kwa plasmid pRS306. Icifumamo pRGS7 calisuntinkanishiwe na Pst I ukubikwa mu cifulo ca URA3.
Iciputulwa ca Gas1-GFP icabikwa pamo cilangishiwa mwi samba lya kutungululwa na kacingilila wa GAL1 mu ciputulwa ca pakati (CEN), icapangwa ngefi. Ukukonkana kwa Gas1-GFP kwakulishiwe na PCR ukufuma ku pRS416-GFP (24) (ubupe bwa kwa L. Popolo) no kupanga mu cifulo ca Xma I-Xho I ica muputule wa CEN (ubupe bwa kwa C). Umushili; Inamba ya pulasimidi iyalundwako 51225; 51225; Icilangililo: Icikomo_51225). Icifumamo capeelwe ishina lya kuti pRGS6. Iciputulwa ca Axl2-GFP icabikwa pamo na co cilangishiwa mwi samba lya kutungululwa na GAL1 umubomfi wa pBEVY-GL LEU2, kabili ukukuulwa kwa ciko kuli ngefi. Ukukonkana kwa Axl2-GFP kwakulishiwe ukufuma ku plasmid ya pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) ukupitila muli PCR, no kupanga mu cifulo ca Bam HI-Pst I ica pBEVY-GL LEU2 vector. Icifumamo capeelwe ishina lya kuti pRGS12. Ukukonkana kwa fipe ifibomfiwa muli ili isambililo fyatantikwa pa Ibula S2.
Umusango walilundilweko na 0.2% adenine na 2% umukaka [YP-dextrose), 2% umukaka uwafulilako uwa cifuba p (YP) uwa pa kati (1 % umukaka uwafumyamo umukaka na 2% umukaka uwafumyapo umukaka). (YPR)] nangu 2% umulopa [YP-umulopa (YPG)] nga ntulo ya kaboni, nangu mu cipimo icapangwa icacepako (0.15% umushili wa citutumusi na 0.5% umushili wa ammonium sulfate) ukusanshako amino acid ayalinga ne fishinte ififwaikwa ku fyakulya , Kabili ukukwata 2% umushili wa mushili ( (umusango uunono uwa galactose uwapangwa) nga intulo ya kaboni.
Pakupanga ifikope mu nshita icine cine, amaselo ayatuntulu aya sec31-1 ayalanga ubupangile pe samba lya umubomfi wa GAL1 yakulile mu kati ka YPR pa 24°C ubushiku bonse ukufika pa kati ka ciputulwa ca log. Pa numa ya kubikwa mu YPG pa 24°C pa ora limo, ama cell yasuntinkanishiwe mu SG pa 37°C pa maminiti 30, kabili lyene yasendelwe ku 24°C ku kufumyapo ukufuma ku ciputulwa ca kupanga. Iciputulwa ca A cabomfiwe ku kulungika ama cell pa cikope ca gilasi no kupanga ifikope na SCLIM. SCLIM ni ukusankanya kwa cipe ca kumona ifintu ifinono ifya Olympus IX-71 ne cipe ca kumona ifintu ifinono ica UPlanSApo 100 × 1.4 ica mafuta ayakwata amafuta (Olympus), icayanguka nga nshi kabili icakulisha ica cishibilo-ku-ciunda ica kupilibula ica kwalula ifikope (Yokogawa Electric ne ca kupangapo ifikope ifyalinga). (Ifyakupangapanga ifyakucingilila) kuti fyapeela inshila yakukulisha iyakukulisha iyakulekelesha iya ×266.7 na kamera iyabikwa pamo iyakubomfya amaelekitironi (21). Ukusenda ifikope kulecitwa na sofutiweya iyaipangilwa bwino (Amagetsi ya Yokogawa). Pa fikope fya 3D, twabomfeshe icakubomfya icapangwa bwino bwino ku kukunkuma kwa lensi iyaimikwa, no kulonganika ifiputulwa fya menso 100 nm ukutaluka mu cibumba. Icikope ca Z-stack cipilibulwa mu fishinka fya 3D, kabili umulimo wa kusabankanya kwa fishinka ifibomfiwa ku cipimo ca kumona ifinono ifibomfiwa ku kubomfya kwa mapulogalamu ya Volocity (PerkinElmer). Ukubomfya programu wa Volocity ku kufwailisha kwa cifulo cimo cine, ERES ukubikapo ne fipe fyapimilwe. Ukufwailisha kwa mishilwa kwacitilwe ukubomfya programu wa MetaMorph (Ifibombelo fya Mamolekyu).
Bomfyeni programu wa GraphPad pakuti mwishibe ubucindami bwa fipendo. Pa kwesha kwa basambi ukwa micila ibili no kwesha kwa musango umo ukwa kufwailisha ukwapusana (ANOVA), ukupusana pa kati ka mabumba kwamonwa ukuti kuli no kukwata ubusuma ubukalamba pa P <0.05 (*).
Pa kumona ifintu ifinono ifya Gas1-GFP, ama cell ya ciputulwa ca log yakuliile ubushiku bonse mu YPD no kulonganika ukupitila mu kusamba, ukusamba imiku ibili na mucele uwa phosphate, no kubikwa pa ice pa maminiti 15, elyo no kutwalilila mwi samba lya cimonwa nga fintu calondolwelwe kale (42). Icipe ca kumona ifintu ifinono ica Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 amafuta ya PH3 CS) icakwata icipe ca kumonapo ifintu, ica kufwala ica L5 (GFP), ica kufwala ica Hamamatsu ne ca kufwala ica kufwala ica kufwala ica kufwala ica kufwala ica kufwala. .
Ifyakumwenako fyalyalwike ne fyakumwenako ifya SDS pa 65°C pa maminiti 10, kabili lyene fyalekanishiwa ne fyakumwenako ifya SDS (PAGE). Pa kufwailisha kwa mubili, 10 μl iya cilangililo yalibikwe pa musebo umo umo. Icipope ca kubalilapo: Bomfyeni umuti wa kalulu uwa kulwisha umupashi 1 pa kucefyako 1:3000, umuti wa kalulu uwa kulwisha Emp24 pa kucefyako 1:500, na kalulu uwa kulwisha umulilo uwa GFP (ica bupe ukufuma kuli H. Riezman) pa kucefyako 1:3000. Iciputulwa ca nkumba ica bulwele bwa Pgk1 cabomfiwe pa kucefyako 1:5000 (ica bupe ukufuma kuli J. de la Cruz). Iciputulwa ca bubili ica kulwisha ubulwele: Icilonganino ca mbushi ica kulwisha ubulwele bwa kalulu (IgG) icabomfiwa pa kucefyako 1:3000 (Ukubomfya). IgG iya mbushi iyabikwa pamo iya HRP yabomfiwe pa kucefyako 1:3000 (Ukubomfya). Iciputulwa ca kwasuka kwa bucingo bwa mubili calimonwa ukupitila mu nshila ya kulanga ubutuntulu iya cishibilo ca ku masamba ya Pico (Ifya sayansi ifya Thermo Fisher).
Nga fintu calondolwelwe mu (31), ukufwailisha kwa cifyalilwa ukwa kucingililwa ku malwele kwacitilwe pa ciputulwa ca ER icafulilako. Mu kucefyako, sambani amaselo ya citutumusi ne cibumba ca TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM umukaka wa citutumusi no kusakanisha kwa citutumusi) pa 600 nm (OD600) pa miku ibili. Yalipooselwe ne mipeto ya gilasi, kabili lyene ifiputulwa fya maselo ne mipeto ya gilasi fyafuminepo ukupitila mu kufibomfya. Iciputulwa ca pamulu lyena calipooselwe pa 17,000 g pa maminiti 15 pa 4°C. Iciputulwa ca nshita calibweshiwe mu TNE kabili umuti wa citabo walilundilweko ku cipimo ca kulekelesha ica 1%. Ukuimikwa kwabikwe mu cipe pa ora limo no kupilibuka pa 4°C, kabili lyene ifintu ifishasunguluka fyafuminepo ukupitila mu kufimba pa 13,000 g pa 4°C pa maminiti 60. Pakuti umulilo ulecingililwa ku malwele, intanshi ukubika umulilo pa 4°C pa nsa imo, elyo ukubika umulilo pa 4°C pa maawala yatatu. Amabuula ayasuntinkanishiwe yasambilwe imiku isano na TNE iyakwata 0.2% iya digoxigenin, ukufumishiwapo ne cilangililo ca SDS, ukupaatukana pa SDS-IBUULA, no kupitulukwamo ukupitila mu kufwailisha kwa mubili.
Nga fintu calondolwelwe mu (31), ukushininkisha kwa kulungatika kwacitilwe pa ciputulwa ca ER icafulilako. Mukucefyako, iciputulwa ca ER icafulilako calipooselwemo na 0.5 mM iya dithiobis (ukubomfya ifyakubomfya ifyakupangapanga ifyakupangapanga ifyakupangapanga ifyakupangapanga ifyakupangapanga ifyakupangapanga ifyakupangapanga. Ukucimfya kwakukansana kwazimishiwe ukupitila mukulundako umukaka (50 mM ukusansa kwakulekelesha, amaminiti 5, 20°C).
Nga fintu calondolwelwe kale (50), ukufwailisha kwa MS ukwa ceramide mu misango ya mpanga na GhLag1 kwacitilwe. Mu kucefyako, amaselo yakuliile ukufika ku cipimo ca kucincimusha (3 ukufika kuli 4 amayuniti ya OD600 / ml) mu YPD pa 30 ° C, kabili amaselo 25 × 107 yasontelwe. Ukubomfya kwa fya kulya fyabo kulazimwa na asidi wa trikoloroasetiki. Ukubomfya umuti wa kufumyamo [ethanol, amenshi, ether, pyridine na 4.2 N ammonium hydroxide (15:15:5:1:018 v/v)] na 1.2 nmol iya musango wa mu kati uwa C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) ubusuma). Ukubomfya umuti wa kupanga umubili [umuti wa menshi, amenshi, umuti wa n-buto ne n-buto ya n-buto (4:3:1:5 v/v)] ku kucita ukuwamya kwa menshi ayasuma aya mu menshi, kabili lyene bomfyeni umuti wa n-buto uwakwata amenshi ku kufumya umucele. Mu kupelako, ifyafuminemo fyabweshiwe mu musango usuma uwa menshi [2:7:1) + 5 mM umulopa wa ammonium] no kubikwa mu cipimo ca bukulu. Ukuceeceeta kwa misango iingi (MRM) kwacitilwe ku kusanga no kupima ubukulu bwa ma molekyulu ya mafuta. Icipimilo ca TSQ Vantage ica bukulu bwa fipimo fya mubili (ica sayansi iya Thermo Fisher) cikwata intuntuko ya ion iya nanoflow iya nanomate HD (Ifyakupiminako ifya mweo, Ithaca, NY) ku kupituluka mu mafuta. Amaka ya kukumana yalilungikwa kuli cila ciputulwa ca ceramide. Amashiwi ya MS yasangilwe mu nshila iisuma. Pa cilangililo cimo na cimo ica bumi, icilangililo ca mafuta cili pakati ka mipikile itatu iyaibeela.
Nga fintu calondolwelwe muli (31), amaselo (800 × 107) ayalanga Gas1-GFP yalibikwe mu cifulo ca cifyalilwa ica kucingililwa ku malwele. Iciputulwa ca Gas1-GFP icasanguluka calipaatulwe na SDS-PAGE no kusendwa ku cipe ca PVDF. Iciputulwa ca maproteini calimonwa ukupitila mu kufimba PVDF ne amide iyafiita. Iciputulwa ca Gas1-GFP caputulwe ukufuma ku PVDF no kusamba imiku 5 na methanol kabili umuku umo na menshi aya musango wa MS (LC-MS). Ukupitila mu kufimba umushipa wa cibumba na 500 μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), umuti wa kucingililamo na 500 μl uwasunguluka uwa musango wa sodium nitrite pa 37°C pa maawala yatatu, iciputulwa ca mafuta cilafumiishiwapo ukufuma ku Gas1-GFP no kufumyapo umukaka pakati ka inophamine (51). Pa numa ya ico, umutande wa cibumba walisambilwe imiku ine na menshi ya musango wa LC-MS, ukuumikwa pa muputule wa kufimbilikisha, no kusungwa mu muulu wa nitrogen pa -80°C ukufika ku kufwailisha. Nga cakukonkomesha, icakumwenako icabulamo ica PVDF cabomfiwe kuli cila kwesha. Amafuta ayafumishiwe ukufuma ku Gas1-GFP lyene yapitulwikwemo na MS nga fintu yalondolwelwe (50). Mu kucefyako, imishipa ya PVDF iyakwata amafuta ya GPI yalibweshiwe mu 75 μl iya musango wa kupanga umubili uwabipa [1:2) + 5 mM ammonium acetate] kabili yapitile mu kufwailisha kwa misango ya mafuta ya mubili (TSQ Vantage). Muli iyi nshita, amashiwi ya MS yasangilwe mu musango wa ion uwabipa.
Nga fintu calandwapo kale, iciputulwa ca mafuta ica nkonkoni ya GPI calipaatulwe ukufuma ku [3H] -inositol-iyalembelwepo GPI-AP (16). Amafuta yalipaatulwe ukupitila mu kufwailisha kwa fipimo ifinono ukubomfya inshila ya kusungushamo (55:45:10) no kumonwa ukubomfya FLA-7000 (Fujifilm).
Ama cell ayalanga Gas1-GFP (600×107) yasambilwe imiku ibili ne cipe ca TNE ne cipe ca TNE, kabili yaputulwe ne fipe fya gilasi, kabili lyene yasuntinkanishiwe ku kufumyapo ifiputulwa fya maselo ne fipe fya gilasi. Iciputulwa ca pamulu lyena calipooselwe pa 17,000 g pa ora limo pa 4°C. Iciputulwa ca nshita calisambilwe mu TNE no kubikwa mu cipe ca 1 U PI-PLC (Icipe ca kufimbapo) mu TNE icakwata 0.2% ica cipe ca ciko pa nshita ya ora limo pa 37°C. Pa numa ya kupanga umubili, umubili wafuminepo ukupitila mu kufimba pa 17,000 g pa 4°C pa ora limo. Pa kucingilila umulilo ku malwele, ifya pa muulu fyabikwe pamo na GFP-A (ChromoTek) pa 4°C ubushiku bonse. Gas1-GFP iyasanguluka iyapaatulwe na SDS-IBUULA lyalibikwe ne buluu iyabuuta iya Coomassie. Iciputulwa ca Gas1-GFP ica kufimbapo icaputulwe ukufuma ku fitulukila ifyashingulukile umumana, elyo panuma ya kupanga umukaka no kucefyako umukaka, ukugaya ifya kulya mu gel na trypsin kwacitilwe. Ukufumya no kuuma amapepala ya tryptic na amapepala ayakwata GPI-glycans. Peptide iyauma yalisungululwe mu menshi 20 μl. Ukubika iciputulwa (8μl) mu LC. Iciputulwa ca ma peptide (ODS) icabomfiwe ku kupaatulako ama peptide mu mibele yapusanapusana. Iciputulwa ca kusendamamo ni cilya ica kusungusha A (0.08% asidi wa formiki) ne cisungusho B (0.15% asidi wa formiki mu 80% asidi wa formiki). Ici citabo cabomfiwe ku kufumyapo umutuntulu A mu maminiti 55 pa mushinku wa 50 μl min-1 pa maminiti 5, kabili lyene umuti B walikulishiwe ukufika kuli 40%. , icalo ca ku America). Iciputulwa ca nshita cakonkenyepo ukubikwa mu ntulo ya ion iya ESI, kabili ifiputulwa fya nshita ifyakwata ama peptides ayakwata GPI-glycans fyapitulwikwemo na LTQ. Mu kupanga kwa MS, amaka ya ntulo ya mishipa yabikwe ku 4.5 kV, kabili ukutenta kwa mishipa ya kutwala kwasungilwe pa 300 ° C. Amaka ya muputule wa muputule na maka ya muputule wa muputule fyabikwe kuli 15 V na 50 V, ukulingana. Ilyashi lya MS lyasangilwe mu musango wa ion uwasuma (ukusalapula kwa 60,000; ukulungatika kwa bukulu bwa fiputulwa 10 pa milioni) mu cipimo ca bukulu bwa 300/m/z ubukulu/umutengo wa cipimo (m/z) 3000. ukukansana ukwaleta ukukansana (CID)].
Ukulinganisha kwa MD kwacitilwe ukubomfya programu wa GROMACS (52) na Martini 2 amaka ya mpanga (53-55). Ici cibumba ca CHARMM GUI (56, 57) lyena cabomfiwe ku kukuula ifiputulwa fibili ifyakwata umulopa uwakwata umulopa uwakwata umulopa uwakwata amafuta ayasuma (DOPC) na Cer C18 nangu DOPC na Cer C26. Ubutantiko bwa Cer C26 bwafuma ku DXCE ukupitila mu kufumyapo imipeto iyalundwako ukufuma ku mucila wa cipimo. Bomfyeni inshila iyalondolwelwe pesamba ku kulinganya ifiputulwa fibili no kufibomfya, lyena bomfyeni ama coordinate ya kulekelesha aya mibombele ku kukuula imibombele iyakwata Emp24. Iciputulwa ca cifuba ica cifuba Emp24 (ifyashalapo 173 ukufika kuli 193) capangilwe nga α-helix ukubomfya ifibombelo fya kumona ifya MD (VMD) ifya mipangilwe ya fipimo fya fipimo (58). Lyena, panuma ya kufumyapo amafuta ayasankanishiwe, umulopa walibikwe mu fiputulwa fibili ukubomfya CHARMM GUI. Inshila ya kulekelesha ili na 1202 na 302 iya C26 nangu 1197 iya 295 iya C18 na Emp24. Ukubika inshila ukufika ku cipimo ca 0.150M. Imisango ine iyaibela yapangilwe ku mipangilwe ya fipimfya fibili.
Iciputulwa ca mafuta cilinganishiwa ukubomfya inshila ya CHARMM GUI, iyo iisanshamo ukucefyako no kulinganya intanshi 405,000, apo ifishinte fya cifulo ficefiwa panono panono no kufumishiwapo, kabili intanshi ya nshita ilakulilako ukufuma pali 0.005 ps ukufika kuli 0.02 ps. Pa numa ya kulinganya, cipanga 6 μs ne nshita ya 0.02 ps. Pa numa ya kubika Emp24, bomfyeni inshila imo ine iya CHARMM GUI ku kucefyako no kulinganya inshila, kabili lyene ukubomba pa 8 s mu kupanga.
Pa mibombele yonse, mu nshita ya kulinganya, ukukakatika kulakonkwa na cipimo ca Berendsen (59), kabili mu nshita ya kupanga, ukukakatika kulakonkwa na cipimo ca Parrinello-Rahman (60). Mu milandu yonse, ukukakatika kwalinga kuli 1 bar kabili umusango wa kukakatika uwalinga ulabomfiwa. Mu kulinganya no kupanga, umulilo (61) uwakwata ukubwekeshapo kwa bwangu bwangu ulebomfiwa ku kupanga umulilo wa maproteini, amafuta ne fipimfya fya mubili ukulingana. Mu nshita yonse iya mulimo, ukutenta kwa kufwaya kuli 310K. Ukulanshanya ukwabula ukuminkanya kwapendelwa ukupitila mu kupanga umutande wa babili ukubomfya ubutantiko bwa Verlet ubwakwata 0.005 ukushipikisha kwa buffer. Ishiwi lya Coulomb lyapendelwa ukubomfya umuputule wa kwasukapo no kucefyako ubutali bwa 1.1 nm. Ishiwi lya Vander Waals libomfya inshila ya kuputulamo iyakwata ubutali bwa 1.1 nm, kabili inshila ya kuputulamo iya Verlet ilabomfiwa ku kusendwa ukwalinga (62).
Ukubomfya VMD, ubutali bwa mabimbi ubwaputulwa pakati ka mipeto ya DOPC nangu imipeto ya AM1 na mapulotini ni 0.7 nm, kabili impendwa ya mafuta ayabombela pamo na mapulotini ilapendelwa. Ukulingana na mafomula yakonkapo, pekanishisheni umusango wa kucefyako-ukunonsha (DE) nga fintu cili mu (63): Umutengo wa DE = (umutengo wa mafuta yonse aya mu protein 0.7) mu protein 0.7 (umutengo wa Cer mu mafuta yonse)
Umutengo uwalandwapo usangwa nga calinga, kabili imipeto ya filubo ni ma kopi yane ayaibela aya SE. Ubucindami bwa fipendo ifya DE ubupendelwe ukupitila mu kwesha kwa t [(umupaka wa DE-icishinka-1) / SE]. Balani umutengo wa P ukufuma ku kwakanya kwa mucila umo.
Icibombelo ca GROMACS cabomfiwe ku kupenda mapu wa 2D uwa misango ya misango iyakwata Emp24 mu kati ka 250 ns iya kulekelesha iya kufwailisha. Pa kuti pabe mapu wa kunonsha/ukucefyako uwa ceramide, mapu wa bufumo bwa Cer alapaatulwa ku cipendo ca mapu ya Cer na DOPC, kabili lyene alapaatulwa ku kulonganika kwa Cer mu mubili. Icipimilo ca mapu ica langi limo line cibomfiwa.
Pa lwa fishinka fyalundwapo ifya muli ici cipande, mukwai moneni pa Intaneti.
Ici cipande caishibikwa icasalanganishiwa ukupitila mu mafunde ya Citupa ca Kupanga-Icabula Amakwebo, icasuminisha ukubomfya, ukusabankanya no kupanga cipya cipya mu nshila iili yonse, nga ca kuti ukubomfya kwa kulekelesha te kwa kusanga indalama kabili icishinka ca kuti umulimo wa kubalilapo walilungama. Kuloshako.
Ishiba: Tulemulomba fye ukulemba akeyala kenu aka email pakuti umuntu uo mulepandako amano kwi buula aishibe ukuti mulefwaya ukuti amone email kabili te spam. Tatukakwate amakeyala ya email ayali yonse.
Ici cipusho cibomfiwa ku kwesha nga uli mutandashi no kucingilila ukutuma kwa spam ukwaibela.
Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Lorgihope (Linero), Waga), Misako Arman, Miyako Riman, Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Ifikope ifya 3D ifyalinga nga nshi ifya nshita iine-ine filasokolola ubucindami bwa butali bwa milongo ya ceramide ku kusalulula amaproteini mu fifulo fyakufumyamo ifyasalapo.
Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Lorgihope (Linero), Waga), Misako Arman, Miyako Riman, Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Ifikope ifya 3D ifyalinga nga nshi ifya nshita iine-ine filasokolola ubucindami bwa butali bwa milongo ya ceramide ku kusalulula amaproteini mu fifulo fyakufumyamo ifyasalapo.
©2020 Ibumba lya ku America ilya Kutungulula Sayansi. insambu shonse shasuminishiwa. AAAS ni cibusa wa kwa Hinari, Agora, Oare, KORA, CLOCKSS, Ukukonkana no Kupenda. Ukutunguluka kwa Sayansi 2375-2548.