Pali ino nshita *Akeyala ka nomba: Ukufwailisha kwa Cilonganino ca Kusambililapo pa lwa kwasuka kwa kusakamikwa kwa maselo mu malwele yafuma ku kukota (CECAD).
Ukuonaika kwa mishipa ukwa malwele ya mishipa kwamonwa ukuti tekuti kubwelulushiwe pantu ubutuntulu bwa mishipa bwacepa, lelo ubusuma bwa mishipa ukukanabomba bwino pa maselo ya mishipa mu mubili tabwaumfwikishiwa bwino. Apa, tulelanga ubutuntulu bwa maselo ya Purkinje ayakwata ukubulisha kwa OXPHOS ukwaletwa no kukansana kwa mibombele ya fipindami. Twasangile ukuti ukukanabomba bwino ukwa mishipa kwalengele ukwaluka kukalamba mu fyakupangapanga, mu kupelako ukutwala ku kukonkana kwa mibombele ya mishipa ilyo amaselo tayalafwa. Mu kukanacetekela, twasangile ukutendeka kwaumfwika ukwa PCx na fimbi ifikuma ku kulundapo ifya pa kati ifya TCA. Ukukanshiwa kwa PCx kwakulishe ukusakamikwa kwa mubili no kuonaula kwa mishipa, ukulanga ukuti ukulwala kwa mishipa kuli no kucingililwa mu mishipa iyabula OXPHOS. Ukubweseshamo ukulonganika kwa mishipa mu mishipa iyaonaika kulabweseshamo fyonse ifi ifipimo fya mishipa, eico ukucingilila imfwa ya maselo. Ifyo twasanga filalanga inshila ishishaishibikwe kale ishipeela ukushipikisha ku kukanabomba bwino kwa mishipa no kulanga ukuti ukuonaika kwa mishipa kuti kwabweshiwa nangu fye mu fiputulwa fya kulekelesha ifya bulwele.
Umulimo ukalamba uwa mishipa mu kusungilila amaka ya mishipa ya mubili uleshininkishiwa ku fishibilo ifikulu ifya mishipa ifikuma ku malwele ya mishipa ya muntu. Amalwele ayengi aya yaletwa no kwaluka kwa fimenwa ifitungulula ukumoneka kwa fimenwa ifya mubili (1, 2) nelyo ukuonaula kwa fimenwa ifikuma ku mibele ya fimenwa, ifilenga ukukanalungama kwa DNA ya mubili (mtDNA) (3, 4). Imilimo mu fimpashanya fya nama yalangisha ukuti mu kwasuka ukukanabomba bwino ukwa mishipa mu fipimo fyashinguluka, inshila sha kusunga ifya kulya (5-7) kuti shabomfiwa, eico ukupeela ukwishiba kwacindama pa lwa mipangilwe ya malwele ayakosa. Mu kupusanako, ukumfwikisha kwesu ukwa kwaluka kwa fya kulya ukwa misango imo iya maselo ayaletwa no kukanafikapo kwa bongobongo ukwa kupanga umubili wa bongobongo (ATP) kwalicindama (8), ukushininkisha ukukabila kwa kusanga ifishinka fya kundapa ifingabomfiwa ku kucingilila nelyo ukucingilila ubulwele. Ukucingilila ukuonaika kwa bongobongo (9). Ukukanakwata amashiwi ni cine ca kuti amaselo ya mishipa yamonwa sana ukuti yalikwata ukucepa nga nshi ukwa kupanga ifya kulya ukulingana ne misango ya maselo ya fipimo fyashinguluka (10). Ukupeelwa ukuti aya maselo yabomba umulimo ukalamba mu kulungatika ukupeelwa kwa fya kulya ku fipimo fya mubili ku kutungilila ukutwala kwa synaptic no kwasuka ku kucula na ku mibele ya malwele, amaka ya kwalula imibombele ya maselo ku mibele yafina iya fipimo fya bongobongo mupepi no kufika ku maselo ya glial (11-14). Ukulundapo, ubupusano bwa maselo aya mu fipimo fya bongobongo bulacilinganya ukusambilila pa kwaluka kwa fya kulya ificitika mu mabumba ayanono aya fipimo fya bongobongo. Icafumamo ca kuti, ifinono fye efyaishibikwa pa lwa fifumamo fya maselo na ifya kulya ifyafuma mu kukanabomba bwino kwa mishipa mu mishipa.
Pa kuti twishibe ifyafumamo fya kupanga umubili pa mulandu wa kukanabomba bwino kwa mubili, twalipaatulako ifipimo fyapusanapusana ifya mubili ifyaonaika ifyaletwa no konaulwa kwa fipimo fya mubili ifya kunse (Mfn2). Nangu cakuti ukupilibuka kwa Mfn2 mu bantunse kwapalana no musango wa bulwele bwa ku nsengo ubwaishibikwa nga Charcot-Marie-Tooth umusango wa 2A (15), ukuonaula kwa mibele ya Mfn2 mu nkumba kwaishibikwa bwino bwino ukwa kulenga ukukanabomba bwino ukwa mubili. Imisango yalekanalekana iya mishipa (16-19) ne misango ya mishipa iyafumamo ilakonkana ne fishibilo fya mishipa ifikula, pamo nga ukukansana kwa kucincintila (18, 19) nelyo ukukansana kwa bongobongo (16). Ukubomfya ukusankanya kwa misango ya fimenwa iyabula ifishibilo (LFQ), ifimenwa ifya fimenwa, ifikope, ne nshila sha fimenwa, tulalanga ukuti ukukula kwa fimenwa kulalenga sana ukukansana kwa fimenwa (PCx) na fimbi ifisanshamo ukukansana kwa mishipa ya PNs mu vivo Ukusokolola kwa fimenwa. Pa kushininkisha ubucindami bwa ifi fyasangwa, twacefishe ukusokolola kwa PCx mu PNs iyabula Mfn2, kabili twasangile ukuti uku kubomba kwakulishe ukusakamikwa kwa mubili no kwangufyanya ukubola kwa mubili, eico ukushininkisha ukuti azoospermia ilapeela imfwa ya maselo ukulingana ne fya kulya. Ukusokolola kwabipisha ukwa MFN2 kuti kwapususha umupwilapo ukubola kwa PN ukwa kulekelesha no kubulisha kwa OXPHOS ukwabipisha, ukubomfya kwakulisha ukwa DNA ya mishipa, kabili ukumoneka kwaonaika kwa mishipa, ukukonkanyapo ukushininkisha ukuti uyu musango wa kuonaika kwa mishipa kuti wabwela mu ciputulwa ca kukula ica bulwele.
Pa kuti twingamona ifya mu mubili mu Mfn2 ukucimfya PNs, twabomfeshe umusango wa mbeba uulesuminisha umubili uwashintilila pali Cre ukubika amano ku ma protein ya mutundu wa muntu (YFP) (mtYFP) (20) ukusokolola kwa Cre no kuceeceeta imipangile ya mubili mu vivo. Twasangile ukuti ukuonaula kwa Mfn2 gene mu PNs kuti kwatwala ku kwakanya panono panono ukwa muputule wa fipimo fya mubili (Icikope S1A), kabili ukwaluka kwa kubalilapo kwasangilwe pa milungu 3 iya bukulu. Mu kupusanako, ukucepa kwakulisha ukwa ciputulwa ca maselo ya PN, nga fintu cishininkishiwa ku kuloba kwa Calbindin ukwa kucingililwa ku malwele, takwatendeke ukufika pa milungu 12 iya bukulu (Icilangililo 1, A na B). Ukukanalingana kwa nshita pakati ka kwaluka kwakubalilapo ukwa mipangilwe ya fipindami no kutendeka kwa mfwa ya fipindami fyatulengeshe ukufwailisha ukwaluka kwa mishipa ukwaletwa no kukanabomba bwino ukwa fipindami ilyo amaselo tayalafwa. Twapangile inshila ya kusalululamo amaselo ayabomfiwa ku kupanga amabuula (FACS) ayashintilila pa kupaatulako YFP (YFP +)-ukulanga PN (Icikope 1C), kabili mu nkumba sha kucenjela (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- ukuleka-ukuleka-ukuleka: : L7-cre), pano iitwa CT1BRL (Icikope). Ukuwamya kwa nshila ya kufimbilikisha ukushintilila pa maka ya cishibilo ca YFP kulatulenga ukusangulula umubili wa YFP + (YFPhigh) uwa PNs ukufuma ku bashili ba PNs (YFPneg) (Icilangililo S1B) nelyo ifiputulwa fya axon / dendritic ifyalinga (YFPlow; Icikope S1D, ukushininkisha). Pa kushininkisha ubushininkisho bwa cipendo ca bantu, twacitile LFQ ukufwailisha kwa fiputulwa ifikulu, kabili twasangile ukuti kwali ukwaluka ukwaumfwika pakati ka maselo ya YFPhigh na YFPneg (Icilangililo S1C). 21, 22), lelo takwali ukunonka kwa maprotini ayaishibikwa sana mu fipimo fya mubili nelyo imisango imbi iya maselo (Icikope 1D) ). Ukulinganisha pakati ka ifilangililo mu maselo ya YFPhigh ayasontwa ayalonganikwe mu fyakwesha ifyaibeela fyalangile ubupalamano bwa cipimo> 0.9, ukulanga ukufyalwa bwino pakati ka ifibumbwa fya mweo (Icilangililo S1E). Mukufusha, ifi ifishinka fyashininkishe ubupekanyo bwesu ubwa kupaatukana ukwabipisha kabili ukwalinga ukwa PN iyalinga. Pa mulandu wa kuti inshila ya kutwalamo ifipe iya L7-cre iyabomfiwa ilalenga ukubwekeshapo kwa mosaic mu mulungu wa kubalilapo pa numa ya kufyala (23), twatendeke ukukoma ifipe ukufuma ku CTRL no kufwaya (Mfn2. Pa numa ya kupwisha ukulonganika, ciitwa Mfn2cKO pa milungu 4 iya bukulu. Nga ca kutila twasalile imilungu 8 iya myaka ilyo umusango wa PN walicili uwakosa nangu ca kuti ifiputulwa fya mishipa fyalimonwa (Icilangililo 1B ne Cilangililo S1A). Mu kulonganika, twapimine umutengo wa maprotini 3013, aya mupepi na 22% yashintilila pa fishinka fya MitoCarta 2.0 ifyashintilila pa fipimo fya mubili nga fipimo fya mubili (Icikope 1E) (Icikope 1E) (24). Ukufwailisha kwa misango yalekanalekana iya fimenwa ukwacitilwe pa mulungu walenga 8 kwalangile ukuti fye 10.5% iya maprotini yonse yali ne fya kwaluka ifikulu (Icilangililo 1F na Icikope S1F), pali ifyo amaprotini 195 yali ayacefiwa kabili 120 yali ayacefiwa (Icilangililo 1F). Calicindama ukwishiba ukuti “ukufwailisha kwa nshila sha kupanga” ukwa iyi nshita ya kupanga ifishinka kulangilila ukuti ifimenwa ifyapusanapusana ifyalumbulwa ukucila pali fyonse fyaba mu nshita ya kukanshiwa iya nshila sha kupanga ifya kulya (Icikope 1G). Ica kupapa, nangula ukucefyako ukukongama kwa nshila ishikuma kuli OXPHOS na calcium ukushininkisha ukutendeka kwa mishipa iyabula ukubomba bwino mu PNs iyabula ukusankanishiwa, ifiputulwa fimbi ifisanshamo ukubomfya kwa amino acid fyalikonkwa sana, ifipalene ne mishipa iya mishipa iya P icitika. Ukubwekeshapo amawaya kulakonkana. ukukanabomba bwino.
(A) Ifikope fyaimikilila ifya fiputulwa fya bongobongo ifya CTRL na Mfn2cKO ifilanga ukuloba kwa PNs (ukuloba kwa PNs); ifipimo fyalipusene ne DAPI. (B) Ukupima kwa (A) (ukupitulukamo kwa nshila imo ukwa kwaluka, *** P <0.001; n = 4 ukufika kuli 6 ifibulungwa ukufuma ku nkumba shitatu). (C) Inshila ya mulimo iya kwesha. (D) Ukusabankanya kwa mapu wa kukaba ukwa fishibilo fyaibela kuli Purkinje (pa muulu) na fimbi ifya misango ya maselo (pakati). (E) Icikope ca Venn icilelanga impendwa ya fipindami fya mubili ifyaishibikwa mu PN iyapusanapusana. (F) Iciputulwa ca mulilo ica misango yalekanalekana iya maprotini mu Mfn2cKO pa milungu 8 (ubucindami bwa kucefyako umutengo wa 1.3). (G) Ukufwailisha kwa nshila ya kupanga kulangilila inshila shisano ishacindama isha kutungulula (ukufiita) no kucefyako (ubwa buluu) mu Mfn2cKO PN iyatantikwa nge milungu 8. Ubupiina bwa mimonekele ya protein imo imo iyasangwa bulalangishiwa. Mapu ya kukaba iya gray: umutengo wa P uwalungishiwa. ns, te cacindama.
Amashiwi ya fya maproteini yalangile ukuti ukumoneka kwa maproteini ayapusanapusana I, III, na IV kwacepeleko panono panono. Amabuumba I, III, na IV yonse yalikwete ifiputulwa ifinono ifya mtDNA, lintu amabuumba II, ayalembelwe fye ku nyukiliya, tayakumine (Icilangililo 2A na Icilangililo S2A). . Ukulingana ne fyasangwa mu fya kupangapanga, ukufwailisha kwa fipimo fya mubili ifya bongobongo fyalangile ukuti MTCO1 (iciputulwa ca mubili ica mubili ica mubili ica 1) ica mubili ica mubili ica IV mu PN calicepeleko panono panono (Icilangililo 2B). Iciputulwa ca mtDNA icalembelwepo Mtatp8 calicefiwe nga nshi (Icilangililo S2A), lintu umusango wa cifulo ca ATP icalembelwepo ica nyukiliya cashele icabula ukwaluka, icilekonkana ne ciputulwa ca ATP icaishibikwa ica F1 ilyo ukusokolola kwa mtDNA kwashintilila. Ukupanga kwakonkana. Ukuputula (7). Ukupima umusango wa mtDNA mu fiputulwa fya Mfn2cKO ifyasalapo ukupitila mu kwasuka kwa nshita iine-ine (qPCR) kwashininkishe ukucepa kwa panono panono ukwa mpendwa ya mtDNA. Ukulingana ne bumba lya kucenjela, pa milungu 8 iya bukulu, fye mupepi na 20% iya mulingo wa mtDNA Yalisungilwe (Icikope 2C). Ukulingana na ifi fyasangwa, ukubomfya kwa fipimo ifinono ifya Mfn2cKO PNs ku kusanga DNA kulangilila ukubomfya kwa nshita ukwashintilila pa fipimo fya mubili (Icilangililo 2D). Twasangile ukuti bamo fye abasangilweko mu kuonaula kwa ma protein aya mubili no kwasuka kwasakamikwa balikonkelwepo, ukubikapo Lonp1, Afg3l2 na Clpx, na OXPHOS ifishinka fya kulonganika ifyakosa. Tapali ukwaluka kwacindami mu fipimo fya ma protein ayasangwa mu apoptosis ukwasangilwe (Icilangililo S2B). Mu fyo fine, twasangile ukuti umubili wa muntu uwa mu kati uwa mu kati uwa mubili uwasangwa mu kutwala kwa calcium uli fye no kwaluka ukunono (Icikope S2C). Ukulundapo, ukupituluka mu ma protein ayakuma ku fya kulya fya mubili takwasangile ukwaluka kwacindamisha, ukukonkana no kumoneka kwa fya kulya ifya mubili ifyamonwa mu vivo ukupitila mu fya kupangapanga ifya kupangapanga ne fya kupangapanga ifya kupangapanga (Icilangililo S3). Na lyo line, ukukanabomba bwino ukwa OXPHOS mu PNs kulakonkana no kwaluka kwa mishipa ukwamoneka. Amabumba ya fipindami kuti yamonwa mu mibili ya maselo na mu miti ya fipindami iya Mfn2cKO PNs iya myaka 5 na 8, kabili umusango wa cipindami ca mukati walipita mu kwaluka kwakulisha (Icilangililo S4, A na B). Ukulingana na ifi ifishinka fya kwaluka no kucepa kwakulisha ukwa mtDNA, ukupituluka mu fiputulwa fya bongobongo ifyabipisha ifyakwata umubili wa bongobongo uwabipisha (TMRM) kwalangile ukuti amaka ya bongobongo ayabipisha mu Mfn2cKO PNs yalicepeleko nga nshi (Icilangililo S4C).
(A) Ukupituluka mu nshita ya kulanga umusango wa OXPHOS uwakosa. Tontonkanyeni fye pa ma protein ayakwata P <0.05 pa milungu 8 (ANOVA iya nshila shibili). Umushila wa tudodo: Tapali ukulungika ukulingana na CTRL. (B) Ku kulyo: Ica kumwenako ca ciputulwa ca bongobongo icalembwa ne cipimo ca kulwisha MTCO1 (umusango wa cipimo, 20 μm). Icifulo icakwata imibili ya maselo ya Purkinje cafimbwapo umutuntulu. Ku kulyo: Ukupima imilingo ya MTCO1 (ukupitulukamo mu nshila imo ukwa kwaluka; n = 7 ukufika kuli 20 amaselo ayapitulwikwemo ukufuma ku nkumba shitatu). (C) qPCR ukupitulukamo kwa mtDNA ukukopa impendwa mu PN iyasalapo (ukupitulukamo kwa nshila imo ukwa kwaluka; n = 3 ukufika kuli 7 ifipe). (D) Ku kulyo: Ica kumwenako ca ciputulwa ca bongobongo icalembelwepo ne cipimo ca kulwisha DNA (umusango wa cipimo, 20 μm). Icifulo icakwata imibili ya maselo ya Purkinje cafimbwapo umutuntulu. Ku kulyo: Ukupima ifilonda fya mtDNA (ukupitulukamo mu nshila imo iya kwaluka; n = 5 ukufika kuli 9 amaselo ukufuma ku nkumba shitatu). (E) Ica kumwenako ca ciputulwa ca bongobongo icabipisha icilelanga amaselo ya mitoYFP + aya Purkinje (umupeto) mu kulemba kwa maselo yonse. (F) Ukupima ubukulu bwa IV. (G) Ukulemba kwa kwimininako ukwa kupanga umuti wa nomba line mu maselo ya CTRL na Mfn2cKO. Ukukonka pa muulu: Iciputulwa ca kubalilapo icalengele AP. Ukukonka panshi: Imiku iingi iya AP. (H) Ukupima ifya kwingilamo ifya pa numa (sPSPs). Ukukonka kwakulembwa ukwaimikilila na imilinganine yakwe iyakukulisha fyalangishiwa mu (I). Ukufwailisha kwa nshila imo ukwa kwaluka kwapitulwikwemo n = 5 ukufika kuli 20 ama cell ukufuma ku nkumba shitatu. Amashiwi yalangishiwa nga ayalinga ± SEM; *P<0.05; **P<0,01; ***P<0,001 (J) Ifishibilo fya kwimininako ifya AP ifya kuitemenwa ifyalembwa ukubomfya umusango wa cipimo ca kufimbapo ica kufimbapo. Ukukonka pamulu: Imiku iingi iya AP. Ukukonka panshi: ukupalamika kwa AP imo. (K) Ukupenda umusango wa AP uwalinga no wa pa muulu ukulingana na (J). Ukufwailisha kwa kwa Mann; n = 5 ama cell yapitulwikwemo ukufuma ku nkumba shine. Amashiwi yalangishiwa nga ayalinga ± SEM; te cacindama.
Ukuonaula kwa OXPHOS ukwamoneka kwasangilwe mu Mfn2cKO PN iya milungu 8, ukulanga ukuti umulimo wa mubili uwa fipimo fya mubili walibipile nga nshi. E ico, twapitulwikemo mu mibele ya maka iyabula amaka iya OXPHOS-iyabula ama neurons pa milungu 4 ukufika kuli 5 na 7 ukufika kuli 8 ukupitila mu kucita ukulemba kwa ciputulwa ca nshita ica nshita yonse mu fiputulwa fya nshita ifya nshita (Icikope 2E). Mu kukanacetekela, ukulingana kwa kupuusha kwa cibumba no kukansana kwa kwingilisha ukwa fipimo fya Mfn2cKO fyalipalana no kucenjela, nangu ca kuti kwali ukulekanalekana ukwacepa pa kati ka maselo (Ithebulo 1). Mu fyo fine, pa milungu 4 ukufika kuli 5 iya bukulu, takwali ukwaluka kwacindamisha mu cibusa ca nomba-ica maka (IV curve) ukwasangilwe (Icikope 2F). Na lyo line, tapali ama neurons ya Mfn2cKO aya milungu 7 ukufika kuli 8 ayapuswike ku nshita ya IV (intanshi ya kucincimusha), ukulanga ukuti kuli ukumfwa kwaumfwika ukwa kucincimusha ukwa maka pali iyi nshita ya kulekelesha. Mu kupusanako, mu fipimo fya Mfn2cKO, amabumba ya mishipa ayalenga ukubwekeshapo kwa maka ya kucita (AP) ukufumyapo kwasuminishiwa bwino, ukulanga ukuti imisango yabo yonse iya kufumyamo tayapusanako nga nshi ukufuma kuli iyo iya milungu 8 iya mishipa ya kucenjela (Ithebulo 1 na Icikope 2G). Mu nzila imo ine, imiku iingi no bukulu bwa mibele ya pa numa iya kuitemenwa (sPSCs) fyalilinganishiwe kuli ifyo ifya mwi bumba lya kucenjela, kabili imiku iingi ifyacitike fyalikulile ukufuma pa milungu 4 ukufika ku milungu 5 ukufika ku milungu 7 ukufika ku milungu 8 no kulunduluka kwapalana (Icikope 2, H na I). Inshita ya kukula kwa ku mubili mu PNs (25). Ifyasangwa ifyapalanako fyasangilwe panuma ya fiputulwa fya PNs ifyabombwa. Uku kupanga kulacingilila ukulipila kwa filubo fya ATP ifya maselo, nga fintu cingacitika mu kulemba kwa maselo yonse. Mu kupalako, amaka ya kupuusha aya cibumba no kupanga ifya kupangapanga ifya Mfn2cKO tafyakumine (Icilangililo 2, J na K). Mu kucefyako, ifi fyasangwa filangilila ukuti PNs iyakwata ukukanabomba bwino ukwa OXPHOS kuti yashipikisha bwino bwino imisango ya kufumyapo iya pa muulu, ukulanga ukuti kuli inshila ya kulipililamo iyo ibasuminisha ukusunga amasuko ya mupepi ayalinga.
Amashiwi yalangishiwa nga ayalinga ± SEM (ukupitulukamo kwa nshila imo ukwa kwaluka, ukufwailisha kwa Holm-Sidak ukwa kulinganya ukwafulilako; * P <0.05). Namba ya ciputulwa ilangishiwa mu fibokoshi.
Twatendeke ukufwailisha nga ca kuti umusango onse mu ciputulwa ca fishinka fya ma proteomics (Icikope 1G) uli ne nshila ishingacingilila ukubulisha kwa OXPHOS ukwabipisha, muli ifyo ukulondolola umulandu PN iyakuma kuti yasungilila mupepi-ne-cipimo calinga (Icikope 2, E ukufika kuli K). . Ukufwailisha kwa ma protein kwalangile ukuti ama enzymes ayasangwa mu kupanga ama amino acid ayakwata amasabi (BCAA) yali ayalinga nga nshi (Icilangililo 3A na Icikope S5A), kabili icafumamo ca kulekelesha ica acetyl-CoA (CoA) nangu ica succinyl CoA kuti calundako ku fya kulya ifipya mu mishipa. Twasangile ukuti ifyaba mu BCAA 1 (BCAT1) na BCAT2 fyonse fibili fyalikulile. Bacincishe intanshi iya BCAA ukupitila mu kupanga umukaka ukufuma ku α-umukaka (26). Ifiputulwa fyonse ifipanga umutande wa keto asidi uwakwata amenshi (BCKD) fyalikonkwapo (umusango uukalamba ulelenga ukuti umutambo wa BCAA ulefumamo) (Icilangililo 3A na Icikope S5A). Nangu cibe fyo, tapali ukwaluka ukwamoneka mu BCAA umwine ukwasangilwe mu PN iyasalilwe, iyo kuti yaba pa mulandu wa kulunduluka kwa maselo aya ifi fipimo fyacindama ifya amino asidi nelyo ukubomfya ififulo fimbi (umukaka nelyo umukaka) ku kulundapo ukutendeka kwa TCA (Icikope S5B). PNs abashakwata OXPHOS na kabili balangishe ukufulilako kwa kubola kwa glutamine no kutwala pa ntanshi imilimo pa milungu 8 iya bukulu, iyo kuti yalangishiwa ukupitila mu kucincimusha kwa mubili ukwa mubili (GLS) na GPT2 (Icilangililo 3, A na C). Calicindama ukwishiba ukuti ukukongama kwa GLS kwapelela ku kwaluka kwa Mfn2cKO / CTRL kuli mupepi na 4.5-imiku, P = 0.05), kabili ukukongama kwa iko ukwaibela mu fipimo fya kansa kuti kwaafwilisha umubili wa kansa. (27).
(A) Mapu ya kukaba ilangisha ukwaluka kwa misango mu cipimo ca maproteini pa nshila yatantikwa pa milungu 8. (B) Ica kumwenako ca ciputulwa ca bongobongo icalembwa ne cilwashi ca PCx (umusango wa cipimo, 20 μm). Umufwi uwa mutuntula ulelanga umubili wa maselo ya Purkinje. (C) Ukufwailisha kwa nshita ukwa maprotini ukwaishibikwa ngo muntu uwacindama uwa kufwaya ukulwala kwa mubili (ukufwailisha kwa t ukwafulilako, * FDR <5%; n = 3-5 ifipe). (D) Pa muulu: Icikope ca cilangililo icilanga inshila shapusanapusana isha kwingililamo muli kaboni uwalembelwepo uwaba mu [1-13C] umusebo wa mfula (e kutila, ukupitila mu PDH nelyo inshila ya ku nse). Pa nshi: Icitabo ca violin cilanga impendwa ya carbon iyalembelwepo imo (M1) iyapilibulwa ku asidi wa aspartic, asidi wa citric na asidi wa malic pa numa ya kulemba ifiputulwa fya bongobongo ifyabipisha ne [1-13C] pyruvate (ukufwailisha kwa t ukwabili; ** P <0.01). (E) Ukupitulukamo kwa lyashi lya kale ilya nshita ukwafikapo ukwa nshila yalangishiwa. Tontonkanyeni fye pa ma protein ayakwata P<0.05 pa milungu 8. Umushilwa uwaputulwa: tapali umutengo wa kulungika (ukupitulukamo mu nshila shibili ukwa kwaluka; * P <0.05; *** P <0.001). Amashiwi yalangishiwa nga ayalinga ± SEM.
Mukufwailisha kwesu, ukuwamya kwa BCAA kwasanguka imo iya nshila shacindama isha kutungulula. Ici cishinka cilanga nga nshi ukuti umusango wa mwela uuleingila mu muputule wa TCA kuti wapilibulwa mu PN uushakwata OXPHOS. Ici kuti caimininako umusango ukalamba uwa mishipa iya kupanga ifya kulya, ifingakwata ubupilibulo bwalungama ku mishipa no kupusuka mu nshita ya kusunga ukukanabomba bwino ukwa OXPHOS. Ukulingana na ici cishinka, twasangile ukuti umuti ukalamba uwa kulwisha ukulwala kwa mubili PCx walikonkwapo (Mfn2cKO / CTRL ulaaluka mupepi ne miku 1.5; 30). Ukulingana ne fyasangwa mu fyakupangapanga, ukufwailisha kwa fipimo ifinono kwalangile ukuti ukusokolola kwa PCx kwali ukwakulisha kabili ukwakulisha mu PNs iyabula OXPHOS, lintu ukubomba kwa PCx kwali ukwalinga sana ku maselo ya Bergmann ayapalamine aya kucenjela (Icikope 3B). Pa kwesha ukubomba bwino ukukongama kwa PCx, twapokele ifiputulwa fya bongobongo ifyabipisha ne [1-13C] umukonko wa pyruvate. Ilyo umulopa wa mulopa wafuminemo umulopa (PDH), icishibilo ca iko ica isotope calilubile, lelo calibikwa mu fiputulwa fya pakati ifya TCA ilyo umulopa wa mulopa wapilibulwa ku mibombele ya mishipa (Icilangililo 3D). Mu kwafwilisha amashiwi yesu aya fya kupangapanga, twamwene impendwa iikalamba iya fishibilo ukufuma kuli uyu umukonshi mu fipimfya fya Mfn2cKO, lintu asidi ya citric na asidi ya malic na yo yali ne mibele yalinga, nangu ca kuti tayacindama (Icilangililo 3D).
Mu fipimo fya mubili ifya MitoPark ifya nkumba ifyakwata ukukanabomba bwino ukwaletwa na fipimo fya mubili ifyaonaula umusango wa fipimo fya mubili ifya A (Tfam) (Icilangililo S6B), ukusokolola kwa PCx na ko kwali ukwalinga nga nshi (31), ukulanga ukuti ukukanabomba bwino ukwa mubili ukwa acetone OXFOSI mu mubili. Calicindama ukwishiba ukuti casangilwe ukuti ama enzyme ayaibela (32-34) ayo kuti yalangishiwa mu fipimo fya mubili ifingasangwa ku kupopomenwa kwa mishipa ya mubili ifingasangwa mu PNs ifishakwata OXPHOS, pamo nga umubili wa muntu uwakwata amaka ya kupanga umubili (PCC-A), umubili wa muntu uwakwata amaka ya kupanga umubili (PCC-A), umubili wa muntu uwakwata amaka ya kupanga umubili. (ME3), uo umulimo wakwe uukalamba wa kubwesha umulopa ukufuma ku malate (Icikope 3, A na C) (33, 35). Ukulundapo, twasangile ukulundako kwakulisha mu cipimo ca Pdk3, icilenga ukuti PDH ileke ukubomba (36), lintu takwali ukwaluka ukwasangilwe mu cipimo ca Pdp1 icilenga PDH ukubomba nelyo icipimo ca PDH ica cipimo cene (Icikope 3A). Mukukonkana, mu Mern2cKO PNs, ukuwamya kwa α1 iciputulwa ca α (PDHE1α) ica ciputulwa ca PDH ica mu Ser293 (icaishibikwa ukucingilila umulimo wa enzyme uwa PDH) kwakulishiwe (Icilangililo S6C) (Icilangililo S6C). Pyruvate tayakwata inshila iyakubomfya imishipa.
Mu kupelako, twasangile ukuti inshila iikalamba iya kupanga ifya kulya ifya kulya, ifyapalanako ne fya kulya ifya kulya (1C) ne fya kulya ifya proline (Icikope 1G ne Cikope S5C) fyonse fyalicindama nga nshi, ukulingana na malyashi, mu nshita ya kucincimusha. Ifiputulwa fya mubili ifyashinguluka filabomba no kukanabomba bwino kwa fipimo fya mubili (5-7). Ukufwailisha ukwakonkana ukwa kwafwilisha ifi ifishinka fya ma proteomics kwalangile ukuti mu PN na OXPHOS iyabula, ifiputulwa fya bongobongo ifya nkumba sha milungu 8 fyabikwe mu cipimo ca 2 (SHMT2), icintu cikalamba ica muputule wa bongobongo. Ukucingililwa kwa mubili ukwacindama (Icikope S5D). Mu fiputulwa 13 ifya bongobongo ifyabikwamo umukaka, ukufwailisha kwakukonka ifyakulya fyashininkishe ukukonkanyapo ukukonkanyapo kwakupanga ifyakulya ifyakupangapanga, ukulanga ukuti ukupita kwa misango ya carbon mu fyakupangapanga ifyakupangapanga kwakuliile (Icilangililo S5E). Ukutula apo ifyasuko ifitungililwa na GLS na GPT2 efyo fyalenga ukuti umubili ulepanga umukaka ukufuma ku mubili no kupilibula pa kati ka mubili na α-ketoglutarate, ukukongama kwabo kulangilila ukuti ama neurons ayabula OXPHOS yalikwata ukufwaya kwakulisha ukwa mubili, Ici kuti caba icalinga ukusungilila ukulundako kwa mubili (Fig5). Mu kupusanako kuli ifi fya kwaluka, ukufwailisha kwa proteomic ukwa fipindami fya mu bongobongo ukufuma ku nkumba sha Mfn2cKO isha PN kwalangile ukuti ifi fishinte (ukubikako na fyonse ifya kucingilila umubili) tafyapilibwike nga nshi mu kulanga, eico ukulanga Uku kubwesha kwa fya kulya kwasalapo ku PN iyaonaika (Icikope S6).
Mukufusha, uku kupituluka kwasokolwele imisango yalekanalekana iya kubomfya kwa nshita iya nshila sha misango yalekanalekana iya fyakulya mu PNs. Nangu ca kutila ukubomba kwa mishipa ukwabipa kuti kwalenga kwaba ukulwala kwa mishipa no kupanga cipya cipya (Icilangililo 3E na Icilangililo S5C), kabili nalimo ukwaluka ukwaishibikwa mu mimonekele ya I na IV, ukwaluka mu kupanga kwa serine de novo ni fye Kwamoneke fye mu nshita ya kulekelesha. Ukukanabomba bwino ukwa OXPHOS (Icikope 3E ne Cikope S5C). Ifi fyasangwa filalondolola inshila iyakonkana umo umubili uulenga ukusakamikwa (ukutendeka kwa 1C) na umubili (ukupanga ifintu ifya mweo) fyasuka pamo no kulunduluka kwa mishipa mu muputule wa TCA ku kupanga cipya cipya imibombele ya mishipa.
Ama PN ayabula OXPHOS aya milungu 8 kuti yasunga imibombele ya kucincimusha kabili kuti yapita mu kulundanya kwa mubili ukwacindama ku kulipila ukukanabomba bwino ukwa mishipa. Uku kusanga kuleta ubusuma bwa kuti nangu pali ino nshita, aya maselo kuti yapokelela ubundapishi bwa kucelwa nelyo ukucingilila ukuonaika kwa bongobongo. Ukucelwa. Twapwishishe uku kucitikako ukupitila mu kusangwilako kubili ukwaibela. Mu nshila ya kubalilapo, twapangile umuti wa Cre uwakwata ubulwele bwa AAV (AAV) pa kuti MFN2 kuti yasalapo ukusokolola mu PNs iyabula OXPHOS mu vivo (Icikope S7A). AAV iyalemba MFN2 na mCherry (Mfn2-AAV) fyashininkishiwe mu mibele ya mishipa iya kubalilapo mu vitro, icalengele MFN2 ukulangishiwa mu nshila iyashintilila pali Cre no kupususha imipangile ya mishipa, muli ifyo ukucingilila ukupilibuka kwa mishipa mu MfnKO, B Icikope S2c7). Pa numa, twacitile ifyakwesha mu vivo ku kutwala mu cituntulu Mfn2-AAV iya milungu 8 ku cipimo ca bongobongo ica Mfn2cKO no kucenjela ifipe, no kupituluka mu fipe ifya milungu 12 (Icikope 4A). Imbeba sha Mfn2cKO ishaposhiwe shalifwile (Icilangililo 1, A na B) (16). Ukupilibula kwa ba virus mu vivo kwalengele ukusalapo kwa PN mu fipimo fimo ifya bongobongo (Icilangililo S7, G na H). Ukutumpa kwa AAV ukwa kucenjela ukulanga fye mCherry (Ctrl-AAV) takwali na maka ayacindama pa cipimo ca kuonaula kwa bongobongo mu nama sha Mfn2cKO. Mu kupusanako, ukupitulukamo kwa Mfn2cKOs ukwapilibulwa na Mfn2-AAV kwalangile ubucingililo bwacindama ubwa muputule wa maselo ya PN (Icilangililo 4, B na C). Mu kupalako, ubufuuke bwa neuron bumoneka ukuba mupepi no kukanapusana ukufuma ku nama sha kucenjela (Icikope 4, B na C, ne Cikope S7, H na I). Ukusokolola kwa MFN1 lelo te MFN2 kulabomba bwino mu kupususha imfwa ya mishipa (Icilangililo 4C na Icilangililo S7, C na F), icilanga ukuti ukusokolola kwa MFN1 ukwa ectopic kuti kwafikilisha bwino bwino ukukanakwata kwa MFN2. Ukufwailisha nakumbi pa mulingo umo uwa PN kwalangile ukuti Mfn2-AAV mu kupalako yapuswishe umusango wa fipimo fya mubili, ukuwamya ifipimo fya mtDNA, no kubwesha ukusokolola kwakulisha ukwa cishibilo ca PCx (Icilangililo 4, C ukufika kuli E ). Ukumona kwa kumona ukwa nkumba sha Mfn2cKO ishapuswike mu cifulo ca kupuusha kwalangile ukuti imibele yabo ne fishibilo fya kucincimusha (ukucincintila S1 ukufika kuli S3) fyalilungishiwe. Mukulekelesha, ifi fyakwesha filalanga ukuti ukucelwa ukubweseshamo MFN2 mu PNs iyabula nga nshi mu OXPHOS kwalinga ukubweseshamo ukubomfya kwa mtDNA no kulenga ukulwala kwa mishipa, eico ukucingilila ukubola kwa axon no kufwa kwa mishipa mu vivo.
(A) Icilangililo cilanga inshita ya kwesha iya kupanga AAV ukulemba MFN2 ilyo inshila ya kupanga ifya kulya iyalangishiwa ilebomba. (B) Ifikope ifilangisha ifya milungu 12 ifya fiputulwa fya bongobongo ifya milungu 12 ifyapilibulwa ne nkumba sha Mfn2cKO pa milungu 8 kabili ifyalembwa ne cilwashi ca Calbindin. Ku kulyo: Ukupima kwa fipimo fya axon. Ubukulu bwa kukula kwa axon ni 450 na 75 μm. (C) Ku kulyo: Ukupima ubukulu bwa maselo ya Purkinje mu ciputulwa ca kupilibula ica AAV (AAV +) (ukupitulukamo kwa nshila imo ukwa kwaluka; n = 3 ifipe). Ku kulyo: ukupitulukamo kwa mtDNA mu PN iyapilibulwa pa mulungu 12 (ukufwailisha kwa t ukwabula babili; n = 6 amaselo ukufuma ku nkumba shitatu). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Ukwimininako ukutuma kwa ma electron ukwa PNs ukwa fiputulwa fya bongobongo ifya Mfn2cKO ifyapilibulwa ne fipe fyalangishiwa ifya virus. Icipe ca kufimbapo ica pinki cilangisha icifulo icakwata ama dendrite, kabili icikope ca mutundu wa muntu icakwata amatontonkanyo ya mutundu wa muntu cilangisha ukukulisha kwapeelwa ku kulyo; n aiminina umutuntulu. Umupiminako, 1μm. (E) alangisha ica kumwenako ca PCx ukubika mu PN ukupilibulwa pa milungu 12. Umupimilo wa cipimo, 20μm. OE, ukucilapo ukusosa; FC, ukupilibula ukupilibula.
Mukulekelesha, twafwailishe ubucindami bwa kupusuka kwa maselo ayaletwa na peroxidase mu PNs ayakwata ukukanabomba bwino ukwa OXPHOS. Twapangile mCherry iyalembelwe AAV-shRNA (RNA iyapiipi iya nkanda) iyalungama ku nkumba PCx mRNA (AAV-shPCx), no kubika ubulwele bwa nkumba nelyo ukukongama kwa iko ukwapusanapusana (AAV-scr) mu bongobongo bwa nkumba sha Mfn2cKO. Ukutumpa kwacitilwe mu mulungu walenga bune uwa myaka (Icilangililo 5A) ku kufikilisha ukukoma kwa PCx ukwafikapo mu nshita ilyo ukusokolola kwa PCx kwakulile (Icilangililo 3C) kabili umusango wa maselo ya PN walicili uwalinga (Icilangililo 1A). Calicindama ukwishiba ukuti ukuonaula PCx (Icikope S8A) kutwala ku kucincimusha kwakulisha ukwa mfwa ya PN, iyo e mpembe fye iyakanishiwa iya kulwalilila (Icikope 5, B na C). Pa kuti twishibe ifyo ifintu fyaba mu fya kulya ififuma mu PCx, twasambilile pa lwa mibele ya redox iya PNs pa numa ya kuonaula kwa PCx kabili AAV-iyapitilila pa nshita imo ine yalilangishiwe (Icilangililo S8, B ukufika kuli D) ku kupima umusango wa kwaluka kwa mubili (Icilangililo S8, B ukufika kuli D). Lyena, twacitile ifiputulwa fya bongobongo ifya milungu 7 ifya Mfn2cKO nelyo ukukonkomesha ifibusa pa kuti twishibe ifya kwaluka mu cifulo ca redox pa numa ya kushininkisha imibele ya FLIM (Icilangililo S8, E ukufika ku G). Ukufwailisha kwalangile ukulundako kwakulisha mu cifulo ca kusansalikwa ica PNs imo iya Mfn2cKO iyabula ukusokolola kwa PCx, iyo iyapusanako ku fipimo fya kucenjela nelyo Mfn2cKO PNs ukusokolola fye shRNA iyasansalikwa (Icilangililo 5, D na E). Ilyo ukusokolola kwa PCx kwacefiwe, impendwa ya Mfn2cKO PNs ukulanga umusango wa oxided uwakulisha yalikuliile ukucila pa miku itatu (Icilangililo 5E), ukulanga ukuti ukukongama kwa PCx kwasungile amaka ya redox aya fipimo fyaonaika.
(A) Icilangililo cilanga inshita ya kwesha iya kupanga AAV ukulemba shPCx ilyo inshila ya kupanga ifya kulya iyalangishiwa ilebomba. (B) Ifikope ifilangisha ifya milungu 8 iya fiputulwa fya bongobongo ifya milungu 8 mu fipe fya Mfn2cKO ifyapilibulwa no kulembwa ne cilwashi ca kukansha pa milungu 4. Umupimilo wa cipimo, 450 μm. (C) Ukupima ubukulu bwa maselo ya Purkinje mu fipimo fya AAV-ifyapilibulwa (ukupitulukamo kwa nshila imo ukwa kwaluka; n = 3 ukufika kuli 4 ifipe). Amashiwi yalangishiwa nga ayalinga ± SEM; ***P<0,001 (D) Icikope ca FLIM icaimikilila cilanga ubumi bwalinga ubwa PN ubwa milungu 7 ubwa kulanga ubutuntulu bwa Grx1-roGFP2 pe samba lya mibele ya kwesha iyalumbulwa. LUT (itebulo lya kumonapo) umusango: inshita ya kupusukilamo (mu masekondi ayanono). Umupimilo wa cipimo, 25μm. (E) Icilangililo cilanga ukusabankanya kwa mibele ya mweo wa Grx1-roGFP2 ukufuma kuli (D) (n = 158 ukufika kuli 368 amaselo mu nkumba shibili pe samba lya cila cimo). Icilangililo ca pa muulu wa cila cimpashanya: cilanga impendwa ya maselo ayakwata ubumi ubutali nga nshi (ubutuntulu, ubutuntulu) nelyo ubupiina (ubutuntulu, ubucepesha), ubucila pali 1 SD ubwa bumi bwalinga mu CTRL-AAV-scr. (F) Icilangililo capeelwa cilanga ubucingililo bwa kucingililwa kwa PCx iya mubili.
Mu fyonse, amashiwi tupeela pano yalalanga ukuti ukubwekeshapo kwa MFN2 kuti kwapususha umupwilapo PN iyakulisha no kubulisha kwa OXPHOS ukwabipisha, ukucepa kwa mtDNA ukwabipisha, no kukanalinga nga nshi ukwa ista-nga imimonekele, muli ifyo ukupeela ukulunduluka ukwatwalilila nangu fye mu malwele yakulisha. Ukuonaika kwa mishipa kulapeela ubushininkisho bwabweluluka ubwa nshita ilyo amaselo tayalafwa. Ici cipimo ca kwaluka kwa fya kulya cilakoseleshiwa na kabili ku maka ya fipimo fya mubili aya kulenga ukulwala kwa mubili (ukubwekeshapo kwa muputule wa TCA), uucilikila ukusokolola kwa PCx mu PNs ukwabula OXPHOS no kulundulula imfwa ya maselo, muli ifyo ukubomba umulimo wa kucingilila (Icilangililo 5F).
Muli ili isambililo, twalipeele ubushininkisho bwa kuti icasuko ca PNs ku kukanabomba bwino ukwa OXPHOS ni panono panono ukulongana ku TCA ukutendeka kwa mishipa ukupitila mu nshila ya kucincimusha iyapusanapusana iyabomfiwa na mapulogalamu ya fya kulya. Twashininkishe ukufwailisha kwa ma proteomic ne nshila ishingi isha kufikilisha no kusokolola ukuti ilyo twalwishiwa no kukanabomba bwino ukwa mishipa, ama neurons yalikwata umusango uushaishibikwe kale uwa mishipa. Ica kupapa cesu, inshila yonse iya kubweshamo amawaya tayalanga umusango wa fya kulya ifya kulekelesha ifikonkana no kuonaula kwa bongobongo panono panono kabili ukwabula ukubweluluka, lelo amashiwi yesu yalangilila ukuti kuti yapanga umusango wa bongobongo uwa kusunga nangu fye mu nshita ilyo amaselo tayafwa Inshila ya kulipililamo iyabomba. Uku kusanga kulangilila ukuti ama neurons yalikwata umusango ukalamba uwa kupanga ifya kulya mu mubili. Ici cishinka cishininkisha ukuti ukubweseshamo kwa MFN2 pa numa kuti kwabweseshamo ukusokolola kwa fishibilo fyacindama ifya fya kulya no kucingilila ukubola kwa PN. Mu kupusanako, cilacingilila ukulwala kwa mishipa no kulenga imishipa ukubomba bwangu. abaume na banakashi.
Icimo icasangwa ica kupapusha mu kufwailisha kwesu ca kuti PNs iyabula OXPHOS kuti yapilibula imibombele ya TCA ukupitila mu kutungulula ama enzyme ayalenga ukuti umulopa ulebomba bwino. Ukubwekeshapo kwa fya kulya fya mubili ni cimo icaishibikwa ica maselo ya kansa, yamo ayashintilila pa glutamine ku kulundako TCA umuputule wa pa kati ukupanga ifipimo fya kucefyako, ifitungulula umutande wa kupumishishamo no kusungilila ukupanga ifya kulya ifya kulya ifya kulya (39 , 40). Isambililo lya nomba line lyalangile ukuti mu fipimo fya ku mbali ifipita mu kukanabomba bwino ukwa OXPHOS, ukubwekeshapo ukubwekeshapo kwa kupanga umubili wa muntu na kabili cintu cimo icaishibikwa (5, 41), apo ubutungulushi bwa kwingila kwa mubili mu ciputulwa ca TCA bwashintilila pa Pa mulandu wa bukali bwa kucula kwa OXPHOS (41). ). Na lyo line, tapali ubushininkisho bwaumfwika pa kupalana ukuli konse ukwa mibele ya fipindami mu mubili no bucindami bwa iko ubungacitika mu milandu ya bulwele. Mu kusambilila kwa nomba line ukwa vitro, ifipimo fya kubalilapo ifya mubili fyalangishiwe ukulonganika ifishima fya glutamate ku kutwala ifya kulya mu mubili, eico ukutungilila ukuwamya kwa fya kulya no kufimba kwa mishipa mu mibele ya kusakamana kwa fya kulya (42). Calicindama ukwishiba ukuti mu nshila ya kukansha kwa miti ikola iya TCA iya muputule wa muputule, ukusansa kwa pyruvate kwasuminwa ukusungilila ukupanga kwa oxaloacetate mu fipindami fya mubili ifyakulishiwa (34). Na lyo line, ubucindami bwa mubili ubwa iyi mibombele ku fipimo fya bongobongo (uko ubulwele bwa ku bongobongo bwasuminwa ukuti bwaba fye ku fipimo fya mubili) bucili buli no bucindami bwacindama ubwa ku mubili (43). Mu cifulo ca fyo, ifyebo fyesu filalanga ukuti PNs iyaonaika na OXPHOS mu mubili kuti yapilibulwa ku kuonaula kwa BCAA no kupanga umubili, ifintu fibili ifikulu ifya kusanshamo ifya kulya fya mu kati ifya TCA. Nangu cakutila ukusangwilako kwa BCAA ukwa kupanga amaka ya mubili kwapeelwa, ukulunda pa mulimo wa glutamate na GABA ku kutwala kwa mubili (44), tapali ubushininkisho bwa ifi ifibombelo mu vivo. Eico, cayanguka ukutontonkanya ukuti PNs ishishabomba kuti shalipila fye ukubomfya kwa TCA ukwa pa kati ukutungululwa ne nshila ya kusambililamo ukupitila mu kulundulula ukulwala kwa mishipa. Mu kupalako, ukuwamya kwa PCx kuti kwakabilwa ku kusungilila ukufwaya kwakulilako ukwa asidi ya aspartic, iyo yalangishiwe mu kukula kwa maselo ayakwata ukukanabomba bwino ukwa mishipa (45). Na lyo line, ukufwailisha kwesu ukwa fya kulya takwasokolwele ukwaluka ukuli konse ukwacindama mu cipimo ca mutundu wa muntu mu Mfn2cKO PNs (Icilangililo S6A), icilangisha ukubomfya kwapusanapusana ukwa fya kulya pakati ka maselo ayafulilako na ifipimo fya mubili ifyakonkelepo. Nangu ca kutila inshila ya cine cine iya PCx iya kucincimusha mu fipimo fya mubili ifishabomba mu vivo yashala iyalumbulwa, twalangile ukuti uku kwasuka ukwa bwangu bwangu kulabomba umulimo ukalamba mu kusungilila umusango wa redox uwa fipimo fya mubili, ifyo fyalangishiwe mu fyakwesha fya FLIM pa fiputulwa fya bongobongo. Mu kupalako, ukucingilila PNs ukufuma ku kutungulula PCx kuti kwatwala ku mibele ya oxidated no kwangufyanya imfwa ya maselo. Ukubomfya kwa BCAA ukuonaula no kupanga umubili wa pyruvate te nshila sha kulanga imibele ya fipimo fya ku nse ifya kufilwa ukubomba bwino (7). Eico, filemoneka ukuba icacindama ku fipimo fya mubili ifishakwata OXPHOS, nangu ca kuti te cintu fye cimo, icacindama ku kuonaula kwa mishipa. .
Ubulwele bwa ku bongobongo bwa musango wapusanapusana ubwa bulwele bwa ku bongobongo ubumoneka nga ataxia kabili ilingi line buonaula PNs (46). Ici cipendo ca mishipa cilakwata amaka ya kukanabomba bwino pantu ukuonaika kwabo ukwasalapo mu nkumba kwalinga ukupanga ifishibilo ifingi ifya mishipa ifilanga ubulwele bwa muntu ubwa ku mubili (16, 47, 48). Ukulingana na malyashi, umusango wa nkumba iyapilibulwa iyakwata umusango wa cifyalilwa uwapilibulwa ilakumana no kukanabomba bwino kwa muntu kabili ili no kukanabomba bwino kwa fipimo fya mubili (49, 50), ukushininkisha ubucindami bwa kusambilila ififumamo mu kubulisha kwa OXPHOS mu PNPH. Eico, calinga nga nshi ukusalapo no kusambilila ici cipendo ca mishipa iyaibela. Na lyo line, ukupeelwa ukuti ba PNs balaumfwa sana ku kucincimusha kabili balalanda pa cipimo icinono ica maselo yonse aya bongobongo, ku masambililo ayengi ayashintilila pa omics, ukusalapo ukuipatulula nga maselo yonse na kabili cintu icakosa. Nangu cakutila cipale tekuti cicitike ukufika pa kukanakwata ububi bwa misango imbi iya maselo (icalicindama sana ifipimo fya bakulu), twabikile pamo inshila iisuma iyakukanshamo na FACS pakuti tukwate impendwa iyalinga iya mishipa iyalinga iyakupitulukamo mufipimo fyakukonkapo, kabili tuli na maproteini ayengi nga nshi (mupepi na 3000 (51). Pa kusungilila ubumi bwa maselo yonse, inshila tupeela pano taitulenga fye ukumona ukwaluka mu nshila sha kupanga ifya kulya mu fipindami fya mubili, lelo na kabili ukumona ukwaluka mu fipindami fya mubili ifya mubili, ifilenga ukubomfya kwa fipindami fya mubili ukwalinga ukwa misango ya fipindami fya mubili ifipya. (52, na 53). Inshila tulondolola tayakuma fye ku kusambilila kwa maselo ya Purkinje, lelo kuti yabomfiwa bwangu ku musango onse uwa maselo ku kupwisha ukwaluka kwa fya kulya mu bongobongo ubulwele, ukubikapo na fimbi ifya misango ya kukanabomba bwino ukwa mishipa.
Mukulekelesha, twasangile iwindo lya kundapilamo mu nshita ya iyi nshita iya kupanga cipya cipya ifya kulya ifingabweseshamo umupwilapo ifishibilo ifikulu ifya kusakamana kwa maselo no kucingilila ukuonaika kwa maselo. Eico kanshi, ukwishiba imibombele ya mishipa iyalondolwelwe pano kuti kwapeela amano ayacindama pa lwa miti iingacitika iya kusungilila ubutuntulu bwa mishipa mu nshita ya kukanabomba bwino kwa mishipa. Ukufwailisha kwa ku ntanshi ukwa kufwaya ukuputula ukwaluka mu kwaluka kwa maka mu misango imbi iya maselo ya bongobongo kulafwaikwa ku kusokolola bwino bwino ukubomfya kwa ili funde ku malwele yambi aya bongobongo.
Imbeba sha MitoPark shalondolwelwe kale (31). C57BL / 6N ifipe ifyakwata loxP ukushinguluka ifimenwa fya Mfn2 fyalondolwelwe kale (18) kabili fyalundwako ne fipe fya L7-Cre (23). Icifumamo ca misango ibili iya misango yalekanalekana lyene yasanshiwe ne nkumba sha misango yalekanalekana iya Mfn2/Mfn2loxP pa kupanga ifiputulwa fya misango yalekanalekana ifya Purkinje ifya Mfn2 (Mfn2/Mfn2loxP; L7-cre). Mu ciputulwa ca kupanga, Gt (ROSA26) ukuleka-ukuleka-YFP (ukuleka-mtYFP) kwalembwa ukupitila mu kusankanishiwa ukwalundwako (20). Imibombele yonse iya nama yacitilwe ukulingana na mafunde ya ku Bulaya, aya calo conse na ya filonganino kabili yasuminishiwe na bacilolo ba ku calo ca ku Kabanga, ku Germany. Imilimo ya nama na yo ilakonka ubutungulushi bwa cilonganino ca ku Bulaya ica fya sayansi ya nama sha kufwailisha.
Pa numa ya kulenga umwanakashi uuli ne fumo ukukanaumfwa ubukali, umwana wa nkumba alapaatulwa (E13). Iciputulwa ca mubili caliputulwe mu cipimo ca mucele icalinga ica Hanks (HBSS) icalundwako na 10 mM Hepes kabili capitile pa cipimo ca kwa Dulbecco ica kwalula ica nkunda icakwata umukaka (20 U / ml) na cysteine ​​(1 μg / ml). Ukubika umubili mu DMEM) no kufiputula ukupitila mu kugaya ifya kulya. Ml) pa 37°C pa maminiti 20, kabili lyene ukusendwa mu DMEM ukwalundwako na 10% umulopa wa ng’ombe uwa mu fumo. Ama cell yasontelwe pa fipe fyakufimbapo ifya gilasi ifyafimbwa na polylysine pa bukulu bwa 2 × 106 pa cipe ca 6 cm nangu pa bukulu bwa 0.5 × 105 amaselo / cm2 ku kufwailisha kwa fikope. Pa numa ya maawala 4, umusango walibikwe pa cifulo ca musango uushakwata umulopa uwakwata 1% uwa B27 uwalundwako na 0.5 mM uwa GlutaMax. Ama mishipa ya bongobongo lyena yasuminishiwe pa 37°C na 5% CO2 mu kwesha konse, no kuliishiwa inshita imo mu mulungu. Pakuti pabe ukubikwa pamo mu cipe, 3μl (icipe ca fishima 24) nangu 0.5μl (icipe ca fishima 24) ica ciko icakonkapo ica AAV9 cabomfiwe ku kundapa ifipimo fya mubili pa bushiku bwa bubili mu cipe: AAV9. WPRE.bGH (Icilundwako, inambala ya citabo 105530-AAV9) na AAV9.
DNA iyakonkana iya nkumba Mfn1 na Mfn2 (iyasangwa ukufuma ku plasmid ya Addgene #23212 na #23213, ukulingana) yalilembelwa ne mitantikile ya V5 (GKPIPNPLLGLDST) pa mpela ya C, kabili yasankanishiwa na mCherry mu cibumba ukupitila mu mitantikile ya T2A. Ici cipe cafuma ku Heidelberg TP Dick DFKZ. Ukubika mu cifulo ca kaseti wa tdTomato ukubomfya inshila shaishibikwa isha kupangamo, kaseti yapangilwe mu musana wa pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (Addgene inambala ya cilangililo 28306) ku kupanga pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-V5, Iciputulwa ca nshita ica nshita ya ku ntanshi. Icilangililo icapalana cabomfiwe ku kupanga umusango wa kucenjela uwa pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Pa kuti pabe ukupanga kwa AAV-shPCx, umuti wa plasmid uwa AAV (umubomfi wa AAV, umubomfi wa AAV, uwakwata umutande wa DNA uwakwata umutande wa DNA uulelemba shRNA uulebika amano ku nkumba PCx (5′ 3′) Mu kutungulula kwa mubomfi wa U6, mCherry ilabomfiwa mu kutungulula kwa mubomfi wa CMV. Ukupanga ifipe fya kwafwilisha ifya AAV kwacitilwe ukulingana ne fyo uwapanga ifipe alandile. Mu kucefyako, bomfyeni plasmid iya kutwala iyatwala mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), ukutwala umusebo wa 29 Ukulemba umusango wa cimenwa, pamo pene no kulemba amaproteini ya AAV1 na maproteini ayabomfiwako. Iciputulwa ca mavairasi icafuminemo casangilwe ukupitila mu kutendekelako ukufuuta-ukufuuta mu kusamba kwa ice ukwauma / ethanol na maselo ayasansalikwa mu mucele uwafuuta (PBS). Icipe ca AAV casanguluka ukupitila mu kukanakonkanyapo kwa kusefa kwa mu kati (ama-awala 24 pa 32,000 rpm na 4°C) no kusankanishiwa ukubomfya ica kusefa ica Amicon ica mu kati ica 15. Icipimilo ca genome ica AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 ikope lya genome (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), icalondolwelwe ica cine cine ica AAV1-CAG-FLEX cali nga fintu cali kale). (1.9×1013 GC/ml) na AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Ama neurons ya kubalilapo yafumine mu PBS iyatonta nga ice, ukubikwa mu fipe, kabili lyene ukubikwa pamo mu 0.5% Triton X-100 / 0.5%. Ukupima kwa ma protein kwacitilwe ukubomfya ukupima kwa asidi wa bicinkoniniki (uwa sayansi uwa bashilika abapya). Ama protein lyena yapaatulwe ukupitila mu kubomfya amafuta ya SDS, kabili lyene yasuntinkanishiwe pa cipe ca GE (GE Care). Ukucingilila ififulo ifishaishibikwa no kufimba ne cilwashi ca kubalilapo (mona Ibula S1 pa lwa fishinka) mu 5% umukaka mu TBST (umucele uwa Tris-uwabikwamo Tween), inshila sha kusambamo ne cilwashi ca bubili mu TBST Ukubikamo. Ukufuuta ne cilwashi ca kubalilapo ubushiku bonse pa +4°C. Pa numa ya kusamba, bomfyeni umuti wa bubili uwa kulwisha ubulwele pa maawala yabili pa muputule wa kufimbilikisha. Pa numa, ukupitila mu kusanshamo iciputulwa cimo cine ne cilwashi ca β-actin, ukubika cimo cine kwashininkishiwe. Ukusanga ukupitila mu kwalula ukumoneka kwa miti no kulundulula ukumoneka kwa miti (GE Ubusaka).
Ama neurons ayabikwe kale pa fipe fya kufimbapo ifya gilasi yalibikwe na 4% iya cipe ca kufimbapo (PFA) / PBS pa nshita yatantikwa pa kukaba kwa muputule pa maminiti 10. 100/PBS pa maminiti 5 pa muputule wa kufimbilikisha, kabili lyene mu kucingilila [3% umulopa wa ng’ombe (BSA)/PBS]. Pa bushiku bwa bubili, ifipe fya kufimbapo fyasambilwe ne cipe ca kucingililamo no kufimbapo ne cipe ca kucingililamo icalinga ica fluorophore pa maawala yabili pa muputule wa kufimbilikisha; Mu kupelako, ifilangililo fyasambilwe bwino bwino mu PBS na 4 ',6-diamidino-2 -Phenilindole (DAPI) yalibikwako amabala kabili lyene yalibikwa pa cipe ca kumonapo ifintu ifinono ne Aqua-Poly / Lupili.
Imbeba (umwaume no mwanakashi) shali no kupopomenwa ukupitila mu kupoosa umuti wa ketamine (130 mg/kg) na xylazine (10 mg/kg) no kupeelwa umuti wa kulesha ubukali uwa carprofen (5 mg/kg) , no kubikwa mu cibombelo ca kupopomenwa (Kopd ne cipe ca nkondo). Ukusokolola umutwe no kubomfya icibombelo ca meno ku kucefyako iciputulwa ca bongobongo icalingana ne fupa lya mis (ukufuma ku lambda: umucila 1.8, ku lubali 1, ukulingana ne fifuba IV na V). Ukubomfya inshindano ya syringe iyakosa pa kupanga bwino bwino akabokoshi akanono mu mutwe pa kuti mwionaula umushipa uuli pe samba. Lyena umulopa wa glasi uwacepa uwakokwa ulabikwa panono panono mu cishima icinono (ukufuma pali -1.3 ukufika kuli -1 ku lubali lwa ku nse ulwa cifuba icakosa), kabili 200 ukufika kuli 300 nl AAV ilabikwa mu cishima icinono (Ukufuma) ne mishipa ya ku minwe (Ukufuma pa 100) pa nshita ya 100. amaminiti 10. Pa numa ya kufimba, ubike umulopa pa maminiti na yambi 10 pa kuti ubulwele bwa virus busalanganine fyonse. Pa numa ya kufumyapo imishipa, ulukanda lulasontwa bwino bwino pa kuti ukufimba kwa filonda kucepeko no kuleka inama ukupola. Inyama shaleundapwa ne miti ya kuundapa ubukali (caspofen) pa nshiku ishingi panuma ya kupanga, muli ilya nshita imibele ya mibili yabo yaleceeceetelwa bwino bwino kabili lyene shaleipaiwa pa nshita yasontelwe. Inshila shonse shacitilwe ukulingana ne fishinte fya ku Bulaya, ifya calo ne filonganino kabili fyasuminishiwe na bashilika ba ku calo ca Umwelt na ba ku calo ca ku Kabanga, ku Germany.
Inyama shalepooswa umuti wa kulenga umuntu ukukanaumfwa ubukali, kabili umutima walipooselwe umuti wa 0.1 M PBS intanshi, kabili lyene 4% PFA mu PBS. Iciputulwa ca mubili caliputulwe no kubikwa mu 4% PFA / PBS ubushiku bonse pa 4 ° C. Icipe icakunkuma (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) cabomfiwe ku kupekanya ifiputulwa fya mu kati (50 μm ubutali) ukufuma ku bongobongo uwashintililwapo mu PBS. Ukucila nga ca kuti calumbulwa mu nshila imbi, ukupakasa ifiputulwa ifyakunkuma ukwabula ukulipilisha kwacitilwe nga fintu calondolwelwe pa muulu (13) pa kuteka kwa muputule no kusansabika. Mu kucefyako, ica kubalilapo, ifiputulwa fyasangilwe fyalipooselwe mu menshi na 0.5% Triton X-100/PBS pa maminiti 15 pa muputule wa kufimbilikisha; pa fipe fimo (Pcx na Shmt2), ukupitila mu cipe ca EDTA pa 80°C (PH 9) ukufuuta ifiputulwa pa maminiti 25 ukucila pali iyi nshita. Pa numa, ifiputulwa fyalibikwe mu cifutu ca kubalilapo (mona Ibula S1) mu kucingilila (3% BSA / PBS) pa 4 ° C ubushiku bonse no kusansabika. Ubushiku bwakonkelepo, ifiputulwa fyasambilwe ne cipe ca kucingililamo no kufibika mu cipe ca kucingililamo icalinga pa maawala yabili pa muputule wa kufimbilikisha; mu kupelako, ifiputulwa fyasambilwe bwino bwino mu PBS, ukubikwako amabala na DAPI, kabili lyene ukubikwa pamo na AquaPolymount Pa cipe ca kumona ifintu ifinono.
Icipe ca kumona ifintu ifinono ica laser (TCS SP8-X nangu TCS Ibula lya lubuuto lwa citabo, ifipe ifinono ifya Leica) icakwata ulubuuto ulwabuuta na laser iyabuuta iya 405 cabomfiwe ku kupanga icikope ca cilangililo. Ukupitila mu kusekesha umulilo no kulonganya ifishibilo ne fyakufwailako ifya misango yalekanalekana (HyDs), ubupe bwa LAS-X bwabomfiwe ku kulonganika ifikope ifyabikwa pamo ukulingana ne misango ya Nyquist mu nshila iyakonkana: ku fipe ifishili ifyalinga, ifishibilo fyacindama nga nshi (ku cakumwenako, mu maselo ya mubili na ifipendo fya mubili) mt Umusango waR uwabengeshima). Ukucingilila 0.3 ukufika kuli 6 ns kulabomfiwa ku kucefyako intanshi.
Ukukopa kwa nshita icine cine ukwa maselo ayasalwa. Pa numa ya kusalapo mu cipimo ca mu kati icakwata 1% iya B27 iyalundwako na 0.5 mM GlutaMax, ama cell yasontelwe bwangu bwangu pa fipe fya glasi ifyafimbwapo poly-l-lysine ( ukuipekanya. Ukufwailisha kwa nshita icine cine kwacitilwe pa cipe ca kufwailisha ica Leica SP8 icakwata ica kufwala icabuuta, HyD, 63×
Imbeba yalipooselwe bwangu bwangu umupashi wa carbon dioxide no kuputulwa umutwe, bongobongo yalifumishiwepo bwangu bwangu ukufuma ku mutwe, no kucendwa mu 200μm ubutali (ku kwesha kwa 13C ukwa kulemba) nangu 275 μm ubutali (ku kwesha kwa ma photon yabili) iciputulwa ca sagittal icaiswilemo ifintu ifikonkelepo ifya crece The VH-5. 125 mM iyatonta nga ice, iyakwata carbon (95% O2 na 5% CO2) iyacepa Ca2 + amenshi ya bongobongo ayapangwa (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phos2. 0.5 mM CaCl2 na 3.5 mM MgCl2 (ukucincimusha kwa mubili ukwa 310 ukufika kuli 330 mmol). Ukusenda ifiputulwa fya bongobongo ifyasangwa ku muputule wa kutendekelako ukubikwamo umulopa uwakulisha uwa Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-shuga pH 7.4 na 310 ukufika kuli 320).
Mu nshita ya kupanga ifikope, ifiputulwa fyasendelwe mu muputule wa kupanga ifikope, kabili ukufwailisha kwacitilwe mwi samba lya kukonkanyapo ukupongolwela kwa ACSF pa kukaba ukwalinga ukwa 32° ukufika kuli 33°C. Icipe icakupiminako ifintu ifinono (TCS SP8 MP-OPO, ifipe ifinono ifya Leica) icakwata ifikope ifinono ifya Leica 25x (NA 0.95, amenshi), Ti: Icipe cakufwailako ica Safire (Icimonwa ca Cikolwe II, Icalinga) cabomfiwe ku kupanga ifikope ifipimfya. Iciputulwa ca FLIM (Icilangililo300, Icilangililo).
FLIM iya Grx1-RoGFP2. Ukupilibuka mu mibele ya PNs kwapimilwe na ma photon yabili aya FLIM mu fiputulwa fya bongobongo ifya pa nshi, apo umutuntulu wa Grx1-roGFP2 walungamike PNs. Mu ciputulwa ca PN, icalo ca kusangamo cisalwa mupepi na 50 ukufika kuli 80 μm pe samba lya ciputulwa ca pa nshi ku kushininkisha ukuti kuli PN iyalinga (ekutiila, ukukanakwata imipangile ya mipeto nelyo ukwaluka kwa mibele ya fipimo fya mubili ukukonka ifipimo fya mubili) na ifipimo fibili ifisuma ifya roGFP2 ne fipimo fya fipimo fya fipimo fya mubili ( mCheri). Ukulonganika ifikope ifya muputule umo ne 2x ukukulisha kwa citabo [ubutali bwa mabimbi aya kucincimusha: 890 nm; Amapikiseli 512 nm 512]. Ukusanga: HyD iya mukati, ibumba lya kusefa ilya FITC] ne cikope icalinga mu maminiti 2 ukufika kuli 3 filabomfiwa ku kushininkisha ukuti amafotoni ayalinga yasontwa (amafotoni 1000 mu cipimo conse) ku kulinganya kwa muputule. Ukucincimuka kwa Grx1-roGFP2 ukufwailisha no kushininkisha imibele ya FLIM fyacitilwe ukupitila mu kuceeceeta umutengo wa mweo wa roGFP2 ilyo balelundako 10 mM H2O2 ku kupongomoka kwa ACSF (ukukulisha ukufumyapo umulilo, ukutwala ku kulundulula ubumi bwa mweo), kabili lyene ukulundako ukucefyako ubumi bwa mweo). ukucefyako, ukulenga ukucepa kwa myaka ya mweo) (Icikope S8, D ukufika kuli G). Ukubomfya programu wa FLIMfit 5.1.1 ku kupituluka mu fyasangwa, ukulingana ne cipimo cimo ica kubola ica cikope conse ku IRF iyapimilwe (umulimo wa kwasuka kwa cibombelo), kabili χ2 ni mupepi na 1. ukubomfiwa ku kupima ubukulu.
Ukufwailisha kwa maka ya mishipa. Pa numa ya ciputulwa cabipisha icabikwamo na 100 nM TMRM iyalundwako ku ACSF iyasansalikwa pa maminiti 30, ukwaluka kwa maka ukwa PNs kwapimilwe ku cipimo ca fipimo fibili. Ukufwailisha kwa TMRM kwacitilwe ukupitila mu kusekesha ukufwailisha pa 920 nm no kubomfya HyD iya mukati (585/40 nm) ku kulonganika ifishibilo; ukubomfya ubutali bwa mabimbi ayapalana lelo ukubomfya HyD iyapusana iya mukati (FITC :525/50) ku kupanga icikope ca mtYFP. Bomfyeni icikope ca ImageJ icakupenda ifikope pa kupima amaka ya mishipa pa mulingo wa cipindami cimo. Mukucefyako, ukulingana kwakubikamo: icilangililo = min (mtYFP, TMRM) cibomfiwa ku kwishiba iciputulwa ca mishipa icilanga icilangililo ca TMRM mu cisomali mu cikope ca muputule umo uwa musebo uwalinga. Lyena incende ya pixel mu cipe icafumamo ilapimwa, elyo kabili ilalinganishiwa pa cikope icalinga ica mtYFP pakuti pabe iciputulwa ca mishipa icilelanga amaka ya mishipa.
Icikope califumishiwepo ukubomfya ubupe bwa Huygens Pro (Icikope ca Bukulu bwa Sayansi). Pa fikope ifyapimwa ifya mataili, ukubikwa pamo kwa tile imo kulacitwa ukubomfya inshila iya kusonkelamo iyapeelwa na programu wa LAS-X. Pa numa ya kupima icikope, bomfyeni ImageJ na Adobe Photoshop pa kuti mulekonkanyapo ukubomba icikope no kulungika bwino bwino ukumoneka no kupusana. Bomfyeni icilangililo ca Adobe pakupekanya ifikope.
Ukupitulukamo kwa mtDNA. Impendwa ya filonda fya mtDNA yapimilwe pa fiputulwa fya bongobongo ifyalembwa ne filwani ifilwisha DNA ukupitila mu cipimo ca kumona ifintu ifinono. Cila cifulo ca kufwaya capangilwe ku mubili wa cipindami na ku cipimo ca cipindami cimo na cimo, kabili icifulo cimo na cimo calipendelwe ukubomfya ica kupiminako icafulilako (sofutiweya wa ImageJ). Ukufumyapo icifulo ca nyukiliya ukufuma ku cifulo ca mubili wa maselo pakuti usange icifulo ca maselo. Mukulekelesha, ukufwailisha ifiputulwa fyakubikamo (sofutiweya wa ImageJ) kwabomfiwe ku kupima ukwaibela ukwa fishinka fya DNA ifyalanga mtDNA pa cikope ca pa mpela, kabili ifyasangwa fyalilinganishiwe ku PN iyalinga iya nkumba sha CTRL. Ifyasangwa filalangishiwa nga impendwa ya fipimo fya mubili pa maselo.
Ukupitulukamo mu mimonekele ya ma protein. Bomfyeni icikope ca ImageJ icakupenda ifikope pa kupima imimonekele ya ma protein mu PN pa mulingo wa cipindami cimo. Mukucefyako, mu cikope ca musango umo ica musebo uwalinga, ukupitila mu cipimo: icilangililo = min (mtYFP, umubili uulwisha), iciputulwa ca mishipa icilanga ubucingo bwa mubili ku cilwashi cimo mu Purkina cilaishibikwa. Lyena incende ya pixel mu cipe icafumamo ilapimwa, elyo kabili ilalinganishiwa pa cikope icalinga ica mtYFP pakuti pabe iciputulwa ca ma protein ayalangishiwa.
Ukupituluka mu bukulu bwa maselo ya Purkinje. Icipe ca kupenda amaselo ica ImageJ cabomfiwe ku kupima ubukulu bwa maselo ya Purkinje ukupitila mu kwakanya impendwa ya maselo ya Purkinje ayapendelwe ukulingana no butali bwa cipe ca bongobongo icakwata amaselo ayapendelwe.
Ukupekanya ifya kumwenako no kulonganya. Ubongobongo ukufuma ku bumba lya kucenjela ne nkumba sha Mfn2cKO shalibikwe mu 2% PFA / 2.5% glutaraldehyde mu 0.1 M umukaka wa phosphate (PB), kabili lyene ifiputulwa fya mubili fyapekanishiwe ukubomfya ifipe fya mubili (Ubufumo 50 ukufika ku 6% mu PBn) 1.5% iya potasiamu pa muputule wa muputule pa ora limo. Ifiputulwa fyasambilwe imiku itatu na menshi ayasansalikwa, kabili lyene fyalembwa na 70% iya ethanol iyakwata 1% iya uranyl pa maminiti 20. Ifiputulwa lyena fyafuminemo amenshi mu bwalwa ubwalinga no kubikwa mu Durcupan ACM (umushili wa Araldite uwa kupanga umushili M) umushili wa epoxy (amasambililo ya pa kompyuta, inambala ya katalogu 14040) pakati ka fipe fya magalasi ifyafimbwa na silikoni, kabili mu kupelako pa 60°C ukubikwa mu citofu. Iciputulwa ca bongobongo ica bongobongo calisalilwe kabili ifiputulwa ifinono ifya 50 nm fyaputulwe pa cipimo ca Leica (Leica Mikrosystem GmbH, Vienna, Austria) no kusalwa pa cipimo ca mukuba ica 2 × 1 mm icafimbwa ne filimu ya polystyrene. Ifiputulwa fyalibikwemo umusango wa 4% uwa uranyl mu H2O pa maminiti 10, ukusamba na H2O imiku iingi, lyena na Reynolds ukutungulula umulopa mu H2O pa maminiti 10, kabili lyene ukusamba na H2O imiku iingi. Ifikope ifinono fyalembwa ne cipe cakutambishishapo ifikope icakubomfya icakubomfya icakupangapanga icakupangapanga icakupangapanga icakupangapanga icakupangapanga icakupangapanga icakupangapanga icakupangapanga icakupangapanga. I Germany).
Ku nkumba ishakwata AAV, bongobongo yalipaatulwe no kucendwa mu ciputulwa ca 1 mm icafina, kabili umubili wa bongobongo walipitulwikwemo ukubomfya icipe ca kumona ifintu ifinono ifyakwata AAV (e kutila, mCherry ukulanga). Ifyakwesha fye umo ukutumpa kwa AAV kwafumamo mu kwalula ukwakulisha ukwa ciputulwa ca maselo ya Purkinje (ekutiila mupepi na ciputulwa conse) mu fipimo fibili ifyakonkana ifya bongobongo ifibomfiwa. Iciputulwa icapilibulwa ica AAV caliputulwe panono pakuti cibe ubushiku bonse panuma ya kufibika (4% PFA na 2.5% umukaka mu 0.1 M umukaka) no kutwalilila ukubombelwapo. Pa kubikamo EPON, umubili uwashintililwapo walisambilwe na 0.1 M umukaka wa koko (Applichem), no kusansalikwa na 2% OsO4 (os, Imilimo ya Sayansi; Caco) mu 0.1 M umukaka wa koko (Applichem) Ama-awala 4, lyene ukusamba pa maawala 2. Ibwekeshapo imiku 3 na 0.1 M umuti wa kokamidi. Pa numa, umutande wa ethanol uwakulilako wabomfiwe ku kusanshamo umuti umo umo uwa ethanol pa 4°C pa maminiti 15 ku kufumyapo amenshi mu fipimo. Iciputulwa ca mubili calesendwa ku muputule wa pa nshi no kufimba ubushiku bonse mu EPON (Sigma-Aldrich) pa 4°C. Bikeni umubili mu EPON upya pa muputule wa muputule pa maawala 2, kabili lyene mubike pa 62°C pa maawala 72. Ubomfye ifipe ifinono ifyakubomfya pa kucemena ifiputulwa ifinono ifya 70 nm, no kufimbapo 1.5% uranyl acetate pa maminiti 15 pa 37°C, no kufimbapo amaminiti 4. Ifikope ifinono ifya pa kompyuta fyalembwa ukubomfya JEM-2100 Plus iya kutwala ifikope ifinono ifya pa kompyuta (JEOL) iyakwata ifikope ifinono ifya 4K 16-bit (Gatan) na programu wa fikope ifinono ifya pa kompyuta (Gatan). Pakupitulukamo, ifikope ifinono ifyakubomfya amalaiti fyasangilwe na 5000× nangu 10,000× ukukulisha kwa citabo.
Ukufwailisha kwa mipangilwe ya fipindami fya mubili. Pa kufwailisha konse, imitantikile ya fipimo fya mubili umo umo yalilondolwelwe mu fikope fya citabo ukubomfya programu wa ImageJ. Ifipimo fya mipangilwe iyapusanapusana filapitulwikwamo. Ukufina kwa fipimo fya mubili kulalangishiwa nga amaperesenti ayasangwa pa kwakanya umuputule onse uwa fipindami fya mubili uwa cila cipindami ku cipimo ca fipimo fya mubili (icifulo ca fipimo fya mubili = icifulo ca fipimo fya mubili-icifulo ca fipimo fya mubili) × 100. Ukushinguluka kwa fipimo fya mubili kulapendelwa ne fomula [4π∙2(icifulo)]./perimeter. Imipangile ya ista iya fipindami fya mubili yalipitulwikwemo no kwakanishiwa mu fiputulwa fibili (“ifya mishipa” na “ifya mubili”) ukulingana ne mimonekele ya fiko iyacindamisha.
Impendwa ya fimenwa ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya no kupituluka mu bufuuke. Bomfyeni programu wa ImageJ ku kulanga imitantikile ya cila cipindami mu cikope ca citabo. Iciputulwa ca fimenwa ifya kulya ifya kulya cilangishiwa nga amaperesenti ayapendelwe ukupitila mu kwakanya icifulo ca fimenwa ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya ifya kulya)×100. Ukufina kwa fimenwa ifya kulya ifya mweo kulapendelwa ukupitila mu kwakanya impendwa yonse ku mpendwa ya fimenwa ifya kulya ifya kulya ifya mweo pa cipimo cimo cimo (mu milandu ya cifulo ca mubili) (icifulo ca mubili = icifulo ca mubili-icifulo ca nyukiliya).
Ukulemba ifyakuputula no kupekanya icakumwenako. Pa fyakwesha ifilefwaya ukulembapo umulopa wa shuga, twala ifiputulwa fya bongobongo ifyabipisha ku muputule wa kutendekelako, uuli ne carbon iyafulisha (95% O2 na 5% CO2), Ca2 + ACSF iyakulisha (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate, 1.25 mM sodium phosphate. 25.0 mM d-shuga, 1.0 mM CaCl 2 na 2.0 mM MgCl 2, ukulungikwa ku pH 7.4 na 310 ukufika kuli 320 mOsm), umo umulopa wa shuga uli 13 Pakwesha ukufwaya ukulembapo pyruvate, twala ifiputulwa fya bongobongo ifyakulisha ku Ca2 + ACSF iyakulisha (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-shuga MgCl2, ukulungika ku pH 7.4 na 310 ukufika kuli 320mOsm), no kulundako 1mM 1- Ukufuuta ifiputulwa pa maminiti 90 pa 37°C. Pa mpela ya kwesha, ifiputulwa fyasambilwe bwangu bwangu ne cisungusho ca menshi (pH 7.4) icakwata 75 mM iya menshi ya ammonium, kabili lyene fyasangilwe mu 40:40:20 (v:v:v) amenshi. Pa numa ya fiputulwa fyabikwa pa ice pa maminiti 30, ifilangililo fyabikwe pa 21,000 g pa maminiti 10 pa 4°C, kabili ifya pa muulu ifya busaka fyaumishiwe mu cipe ca SpeedVac. Icifumamo icauma ica kulya casuminishiwe ukusungwa pa -80°C ukufika pa kupitulukamo.
Ukufwailisha kwa menshi ayapusanapusana aya amino asidi 13 ayalembelwe C. Pa kufwailisha kwa menshi ayapusanapusana (LC-MS), umulopa wa menshi walibikwe mu 75 μl uwa menshi aya musango wa LC-MS (Icishima ca buci). Pa numa ya kusansalikwa pa 21,000 g pa maminiti 5 pa 4°C, 20 μl iya muputule wa pa muulu uwasokolwelwe yabomfiwe ku kufwailisha kwa amino acid, lintu ifyashala ifyafuminemo fyabomfiwe bwangu bwangu ku kufwailisha kwa anion (mona pe samba). Ukufwailisha kwa amino asidi kwacitilwe ukubomfya inshila iyalondolwelwe kale iya kupanga umulopa (55, 56). Mu ciputulwa ca kubalilapo, 10 μl iya 100 mM iya menshi ya sodium (Sigma-Aldrich) yalilundilwe ku 20 μl iya menshi ya mubili, kabili lyene 10 μl iya 2% iya menshi ya menshi (Sigma-Aldrich) yalilundilwe ku LC umusango wa ACN. Icilangililo calisuntinkanishiwe panono kabili lyene calisuntinkanishiwe pa 21,000 g pa maminiti 5 pa 20°C. Ukutwala ifyafuuta ifyafuuta ku cipe ca 2 ml icakubomfya icakubikamo ica gilasi (200 μl ubukulu). Ifyakumwenako fyapitulwikwemo ukubomfya inshila ya LC iyacilapo ukubomba (Amenshi) iyasuntinkanishiwa ku Q-Exactive (QE)-HF (Icipimo cakulisha ica mu mpanga) icakulisha icalinga icakupiminako ubukulu bwa fipe (Ifyakufwailako ifyakupangapanga ifyakupangapanga). Pa kufwailisha, 2μl iya cilangililo cafuminemo yalibikwe mu 100 × 1.0 mm iya maka ya silica T3 umulongo (Amenshi) uwakwata ifiputulwa fya 1.8μm. Ukupita kwa menshi ni 100 μl / min, kabili inshila ya kucingililamo ili no kucingililamo A (10 mM iya musango wa menshi na 0.15% iya asidi ya formic mu menshi) no kucingililamo B (ACN). Iciputulwa ca nshita caba nge fi: 0%B pa maminiti 0; 0%B. 0 ukufika kuli 15% B pa maminiti 0 ukufika kuli 0.1; 15 ukufika kuli 17% B pa maminiti 0.1 ukufika kuli 0.5; B pa 17 ukufika kuli 55% pa maminiti 0.5 ukufika kuli 14; B pa 55 ukufika kuli 70% pa maminiti 14 ukufika kuli 14.5; pa 14.5 ukufika kuli 70 ukufika kuli 100% B pa maminiti 18; 100% B pa maminiti 18 ukufika kuli 19; 100 ukufika kuli 0% B pa maminiti 19 ukufika kuli 19.1; 0% B pa maminiti 19.1 ukufika kuli 28 (55, 56). Ici cipimo ca QE-HF cibomba mu musango wa kupanga ama-ion ayasuma ne cipimo ca m/z (ubukulu/umutengo) ica 50 ukufika kuli 750. Intuntuko ya kupanga amafuta ayapya (ESI) ilabomba pa maka ya kusamba aya 3.5 kV, ukutenta kwa muputule wa 250°C, umupashi wa muputule wa 60 AU (amayuniti ayalinga), no mupashi wa kwafwilisha uwa 20 AU. 250°C Icimonwa ca S cabikwa kuli 60 AU.
Ukufwailisha kwa anion-MS ukwa asidi iyalembelwepo iya 13C. Iciputulwa ca nshita icashala (55μl) calipitulwikwemo ukubomfya inshila ya kufwailisha iya Dionex (ICS 5000+, iya basambilila ifya kupangapanga) iyasuntinkanishiwa ku cipimo ca kupangapanga ica QE-HF (Ifya kupangapanga ifya kupangapanga). Mu kucefyako, 5 μl iya fya kulya fya mubili fyabikwe mu cipimo ca Dionex IonPac AS11-HC icakwata HPLC (2 mm × 250 mm, ubukulu bwa fipimfya 4 μm, ubukulu bwa fipimfya fya mubili) mu cipimo ca kusuntinkanya-mu ciputulwa ca lupi ne cipimo ca kufimbapo ica 1. Umukonko wa kulinda uwa dionex (2 mm x 50 mm, 4 μm, uwa sayansi uwa mulondo wa mulilo). Ukutenta kwa mu cipimo kwasuminishiwa pa 30°C, kabili icakupiminako icaibela cibikwa pa 6°C. Bomfyeni akabokoshi ka potasiamu akapeelwa amenshi ayabula ion pakuti mupange umulilo uwa potasiamu ukupitila mu cipe ca menshi. Ukupaatukana kwa fya kupangapanga pa mushinku wa kupongomoka uwa 380 μl / min, ukubomfya ukukonkapo: 0 ukufika ku maminiti 3, 10 mM KOH; 3 ukufika ku maminiti 12, 10 ukufika kuli 50 mM KOH; 12 ukufika kuli 19 amaminiti, 50 ukufika kuli 100 mM KOH; 19 ukufika kuli 21 amaminiti , 100 mM KOH; 21 ukufika ku maminiti 21.5, 100 ukufika kuli 10 mM KOH. Iciputulwa calibweshiwepo ukulinganishiwa pe samba lya 10 mM KOH pa maminiti 8.5.
Iciputulwa ca nshita ica 150 μl / min ica kusanshako umumana wa isopropanol pa numa ya cipimo kabili lyene citungululwa ku cipimo cakulisha ica kupima ubukulu bwa fimenwa ifibomba mu nshila ya kufitulukila iyabipa. MS ileceeceeta ubukulu ukufuma pali m/z 50 ukufika kuli 750 ukulingana na 60,000. AGC yabikwa kuli 1 × 106, kabili inshita ya ion iyakulisha isungwa pa 100 ms. Intuntuko ya ESI iyafuuta yalibomfiwe pa maka ya kusamba aya 3.5 kV. Ifishinka fimbi ifya ntulo ya ion fyaba nge fi: ukutenta kwa mubili ukwa 275°C; ukupita kwa mupashi wa muputule, 60 AU; AU pa 300°C, no kubika amenso ya S ukufika kuli 60 AU.
Ukufwailisha kwa fishinka fya 13C ifyalembelwepo ifya kulya. Bomfyeni programu wa kufwailisha (umusango 4.2, uwa sayansi iya bashilika) ku kupituluka mu fyebo ifya misango ya isotope. Ubushininkisho bwa cila cibumba bwashininkishiwe na cibumba icashininkishiwa kabili icapitulwikwemo icaibeela. Pa kuti bacite ukufwailisha kwa kulenga ifintu ukuwama, icifulo ca fimenwa ifyafuminemo (XIC) ifya cila cimo ica 13C (Mn) fyafumishiwepo ukufuma kuli [M + H] +, apo n ni nambala ya kaboni iya fimenwa ififwaikwa, iyabomfiwa ku kupituluka mu fimenwa fya amino nelyo [ MH ] + iyabomfiwa ku kupituluka mu fimenwa fya mubili. Ukulungatika kwa bukulu bwa XIC kuli pe samba lya fiputulwa fisano pali milioni, kabili ukulungatika kwa RT kuli amaminiti 0.05. Ukufwailisha kwa kunonsha kucitwa ukupitila mu kupenda ubupiina bwa cila isotope iyasangwa ukufika ku cipimo ca isotope shonse isha musango umo wine. Iyi imilinganine ipeelwa nga amaperesenti ya mitengo kuli cila isotope, kabili ifyasangwa filalangishiwa nga amaperesenti ya molar aya kunonsha (MPE), nga fintu fyalondolwelwe kale (42).
Iciputulwa ca mishipa icakonkoloka calisanshiwe mu menshi ayatonta aya 80% (v/v), ukusansalikwa, no kubikwa pa -20°C pa maminiti 30. Ukupilibula ica kumwenako na kabili no kusansabika pa +4°C pa maminiti 30. Icilangililo calipooselwe pa 21,000 g pa maminiti 5 pa 4°C, elyo icafuminemo calipooselwe no kuumishiwa ukubomfya icakubikamo SpeedVac pa 25°C pakuti cipitulwikwemo. Nga fintu calondolwelwe pa muulu, ukufwailisha kwa LC-MS kwacitilwe pa amino asidi ya maselo ayasalilwe. Ukubomfya icakufwailako (umusango 4.2, icakufwailako icakufwailisha), ukufwailisha kwa fishinka kwacitilwe ukubomfya ubukulu bwa cila cibumba. Ukuwamya kwa misango ya fishinka fya mubili kwacitilwe ukubomfya ubupe bwa mapulogalamu ya pa ntanshi (57).
Ukupekanya ifiputulwa. Imbeba mu kwangufyanya yalipooselwe umupashi wa carbon dioxide no kuputulwa umutwe, bongobongo yalifumishiwepo bwangu bwangu ukufuma ku mutwe, kabili umupeni uwakunkuma uwaiswilemo ice (HM-650 V, CO2) Ukucepa kwa Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-shuga, 1.0 mM CaCl2 na 6.0 mM Mg30 mOsm). Ukusenda ifiputulwa fya bongobongo ifyasangwa ku muputule uuli ne Ca2 + ACSF iyakulisha (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 mM pHC2l) na 310 ukufika kuli 320). Sungeni ifiputulwa pa maminiti 20 ukufika kuli 30 pa kuti fibweshiwepo ilyo tamulalemba.
ukulemba. Iciputulwa ca kumona ifintu ifinono icakwata icipinda cakulembelamo icaimikwa ne cimonwa cakubikamo amenshi 20x (Scientifica) cabomfiwe ku fyakulemba fyonse. Ama cell ya Purkinje ayasuminwa yaishibikwe ukupitila muli (i) ubukulu bwa mubili, (ii) icifulo ca mubili ica bongobongo, na (iii) ukulanga umusango wa mtYFP uwa kulandapo. Iciputulwa ca nshita icakwata ukukaana kwa nsongo ukwa ma megohms 5 ukufika kuli 11 cifumishiwapo ne cipe ca nshita icalinga (P-1000). Ukulembwa konse kwacitilwe na ELC-03XS npi ukukosha kwakubomfya (npi ukwakubomfya amaboko, Tam, Germany), ukwaletungululwa na programu wa cishibilo (umusango 6.0, uwakubomfya amaboko, UK). Icakwesha calembelwe pa cipimo ca 12.5 kHz. Icilangililo cisefiwa ne fipimo fibili ifya Bessel ifyapitapo ifinono ne misango ya kucefyako iya 1.3 na 10 kHz ukulingana. Ukufikapo kwa cibumba na pipette kulalipilwa ku muputule wa kulipila ukubomfya umubomfi wa kucincimusha. Ifyakwesha fyonse fyacitilwe ukupitila mu kutungululwa na kamera iya Orca-Flash 4.0, iyatungulwilwe na programu wa Hokawo (umusango 2.8).
Ukukonkanyapo kwa lyonse ukwa maselo yonse no kupitulukamo. Ilyo line fye ilyo tamulalemba, pongoleni umulopa wa mu kati uwakwata ifintu ifikonkelepo: (Na) na 10.0 mM ifya kulya fya mubili fyalungishiwe ku pH 7.25, kabili ukucincimusha kwa menshi kwali 290 mOsm (umukaka wa menshi). Ilyo line fye panuma ya kubomfya amaka ya 0 pA ku kuputula umubili, amaka ya mubili ayapuusha yapimilwe. Ukucimfya kwa kwingilishamo kupimwa ukupitila mu kubomfya amaka ya -40, -30, -20, na -10 pA. Pimeni ubukulu bwa kwasuka kwa maka no kubomfya ifunde lya Ohm ku kupenda ukukansana kwa kwingilisha. Imilimo ya kuitemenwa yalembwa mu cipimo ca maka pa maminiti 5, kabili sPSC yaishibikwe no kupimwa muli Igor Pro (umusango 32 7.01, Amabumba ya Mabimbi, Icishima ca Oswego, Oregon, USA) ukubomfya ifilembo fya kwishiba ifya pa kati. Iciputulwa ca IV ne ciputulwa ca nshita icashintilila cipimwa ukupitila mu kufimba battery pa maka yalekanalekana (ukutendeka ukufuma kuli -110 mV) no kulundako amaka mu 5 mV intanshi. Ukupanga kwa AP kwalyeselwe ukupitila mu kubomfya amaka ya nomba. Ukukakatika umubili pa -70 mV ilyo ulebomfya umulilo wa nomba uwa kufumyapo amaka. Ukulungika ubukulu bwa ntampulo sha cila ciputulwa ca kulemba ukwapusana (10 ukufika kuli 60 pA). Ukupenda imiku iingi iya AP ukupitila mu kupenda ku minwe ifipimo fya pulse ifilenga imiku iingi iya AP. Iciputulwa ca AP cipitulwikwamo ukubomfya ica bubili icafumamo ica kucincimusha ica kubalilapo ukulenga AP imo nelyo ukucilapo.
Ukukonkanyapo kwa fiputulwa ifyabombwa no kupitulukamo. Ukubomba ukulemba kwa fipimfya ukubomfya imitantikile iyalinga. Ukubomfya umupeto uushakwata ATP na GTP uushakwata ifintu ifi: 128 mM umulopa wa K, 10 mM KCl, 10 mM umulopa wa hepes, 0.1 mM EGTA na 2 mM MgCl2, no kulungika ukufika ku pH 7.2 (ukubomfya KOH). ATP na GTP filafumishiwapo ukufuma mu fyasuko fya mu kati ka maselo pa kucingilila ukukanakonkwapo kwa maselo. Icipe ca kufwala icaisulamo umuti wa mukati uwakwata amphotericin (mupepi na 200 ukufika kuli 250 μg/ml; Iciputulwa ca nshita ica nshita ya ku numa (ukusansa kwa kulekelesha: 0.1 ukufika kuli 0.3%; Ukusansa kwa DMSO ukwabomfiwe takwali na maka ayacindama pa fipimo fya mishipa ifyasambililwe. Mu nshita ya kupanga, ukukaana kwa mu musebo (Ra) kwalitwalilile ukuceeceetelwa, kabili ukufwailisha kwatendeke pa numa ya kuti ubukulu bwa Ra na AP bwashintilila (amaminiti 20-40). Imilimo ya kuitemenwa ipimwa mu cipimo ca maka na / nangu ica nomba line pa maminiti 2 ukufika kuli 5. Ukufwailisha kwa fishinka kwacitilwe ukubomfya Igor Pro (umusango 7.05.2, AmawaveMetrics, USA), Excel (umusango 2010, Icilonganino ca Microsoft, Redmond, USA) na GraphPad Prism (umusango 8.1.2, Amasofutiweya ya GraphPad Inc., La Jolla, CA). Icalo ca ku America). Pakuti mwishibe ama AP ayaisa fye, ukubomfya ifyakubikamo ifya IgorPro ifyakubomfya. Ishibeni APs ukubomfya umupaka uwapeelwa, uo balungisha umo umo kuli cila citabo. Ukubomfya inshita ya kucilikila, ishibeni imiku ya kucilikila ne misango ya kucilikila iyakulisha iya bwangu bwangu ne misango ya kucilikila iyalinga.
Ukuipatulula kwa PN. Ukupitila mu kulinga ku mafunde yapulintwa kale, PNs yasanguluka ukufuma ku bongobongo bwa nkumba pa nshita iyatantikwa (58). Mu kucefyako, umubili wa bongobongo waliputulwe no kucendwa mu cifulo ca kufimbilikisha ica ice [ukwabula HBSS Ca2 + na Mg2 +, ukulundapo na 20 mM shuga, penisilini (50 U/ml) na streptomycin (0.05 mg/ml)], kabili lyene ukugaya umushili mu cifulo ca kufimbilikisha. / ml), papain (16 U / ml) na umulopa wa ku nse (DNase I; 0.1 mg/ml)] Ukuposha pa maminiti 30 pa 30°C. Ica kubalilapo, sambileni ifipimo fya mubili mu cipe ca HBSS icakwata umulopa wa ng’ombe (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) na DNase (0.1 mg/ml) pa muputule wa kufimbilikisha pa kuti mwingacingilila ukugaya ifya kulya, kabili lyene mu cipe ca HBSS icakwata umulopa wa ng’ombe uwa 20 mM. (0.05 mg/ml) na DNase (0.1 mg/ml) filafumya amaselo yamo. 1110 rpm, amaminiti 5, 4°C) no kusendwa na kabili mu cipimo ca kusalulula [HBSS, ukulundapo na 20 mM glucose, 20% umulopa wa ng’ombe / umulopa wa ng’ombe. (0.05 mililitali)]; ukupima ubumi bwa maselo ukubomfya umuti wa kupanga umubili no kulungika ubukulu bwa maselo ukufika kuli 1 × 106 ukufika kuli 2 × 106 amaselo/ml. Ilyo ukupima kwa mubili takulacitika, ukuimikwa kwalesendwa ukupitila mu cipimo ca maselo ica 50 μm.
Icipimilo ca menshi ayapita. Ukusalapula kwa maselo kwacitilwe pa 4°C ukubomfya inshila ya FACSAria III (Ifya Bumi ifya BD) na programu wa FACSDiva (Ifya Bumi ifya BD, umusango 8.0.1). Ukuimikwa kwa maselo kwasalilwe ukubomfya umulomo wa 100 μm pe samba lya kucincimusha kwa 20 psi pa mushinku wa ~ 2800 ifyacitike / sec. Ukutula apo imitantikile ya cifyalilwa iya kwingililamo (ubukulu bwa maselo, ukusalulula kwa misango ibili, ne mibele ya kusansalikwa) tekuti ishininkishe ukwalula kwalungama ukwa PN ukufuma ku misango imbi iya maselo, inshila ya kwingililamo yabikwa ukushintilila pa kulinganya ukwalungatana ukwa maka ya YFP no kuitemenwa mu mitoYFP + no kucenjela kwa mitoYFP. YFP ilasansamushiwa ukupitila mu kusansabika ica kumwenako ne cishibilo ca laser ica 488 nm, kabili icilangililo cisangwa ukubomfya ica kufimbapo ica 530/30 nm. Mu nkumba sha mitoYFP+, amaka ayapalana aya cishibilo ca cishibilo ca Rosa26-mitoYFP nayo yabomfiwa ku kupaatulako umubili wa fipimo fya mubili ne fiputulwa fya fipimo fya mubili. 7-AAD ilasansamushiwa ne laser iya mutundu wa muntu iya 561 nm kabili ilasangwa ne cipe ca 675/20 nm ica kusefapo ukufumyamo amaselo ayafwa. Pa kuti bapaatule amabumba ya mu mulu pa nshita imo ine, ukuimikwa kwa maselo kwabikwepo amabala na ACSA-2-APC, lyene ica kumwenako calipooselweko umutande wa laser uwa 640 nm, kabili umutande wa 660/20 nm walibomfiwe ku kusanga icilangililo.
Ama cell ayalonganikwe yasuntinkanishiwe ukupitila mu kufimba (1110 rpm, amaminiti 5, 4°C) no kusungwa pa -80°C ukufika ku kubomfya. Imbeba sha Mfn2cKO na bana babo abafyashi basontwa pa bushiku bumo bwine pa kucefyako ukwaluka kwa mibombele. Ukulanga ifyebo fya FACS no kufipitulukamo fyacitilwe ukubomfya programu wa FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Nga fintu tulandilepo pamulu (59), PCR iya nshita icine cine ilabomfiwa ku kupaatulako DNA ukufuma ku fipimo fya mishipa ifyasalapo ku kupima kwa mtDNA ukwakonkapo. Ukulingana no kumfwa kwa pa cipimo fyakweshiwe pa kutendeka ukupitila mu kubomfya qPCR pa mpendwa shapusanapusana isha maselo. Mukucefyako, ukulonganika 300 PN mu cipe cakufuuta icakwata 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% pakati ka 20 na K (200 ng / ml) no kufimba pa 55°C amaminiti 120. Ama cell yakonkenyepo ukubikwa pa 95°C pa maminiti 10 ku kushininkisha ukukanabomba kwakumanina ukwa proteinase K. Ukubomfya ukufwailisha kwa TaqMan (Ukufwailisha kwa TaqMan) ukwalinga kuli mt-Nd1, mtDNA yapimilwe ukupitila mu PCR iyalinga mu 7900HT inshila ya PCR iya cine cine (Thermosher). Sayansi, inambala ya citabo Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Ifyakusambilila ifyakupangapanga, inambala ya citabo AIVI3E8) na 18S (Ifyakupangapanga ifyakupangapanga, inambala ya fitabo ifyakupangapanga).
Ukupekanya icakumwenako ica maproteini. Ukupitila mu kupya umusango pa 95 ° C pa maminiti 10 no kucincimusha, mu cipe ca kufimbilikisha [6 M, 10 mM, 10 mM, na 100 mM. Pa maminiti 10 (amasekondi 30 aya kupopomenwa / amasekondi 30 aya kupuuza). Icilangililo calisansabikwe 1:10 mu 20 mM tris-HCl (pH 8.0), ukusankanishiwa na 300 ng ya golde (Promega), no kubikwa ubushiku bonse pa 37°C pa kufikilisha ukugaya kwakumanina. Pa bushiku bwa bubili, ica kumwenako calipooselwe pa 20,000 g pa maminiti 20. Iciputulwa ca pamulu calisansabikwe na 0.1% asidi wa formic, kabili umusango walifumishiwemo umucele ne fyakubomfya ifyapangilwe umwine. Icilangililo caumishiwe mu cibombelo ca SpeedVac (Icibombelo cakubikamo ifyakubomfya pamo na 5305) pa 45°C, elyo umusambo waliimikwe mu 0.1% asidi wa formic. Ifyakumwenako fyonse fyapekanishiwe pa nshita imo ine no muntu umo wine. Pakuti bapitulukemo mufilangililo fya fimenwa ifya mu mulu, 4 μg ifya fimenwa ifyabula umucele fyalembwa ne cishibilo ca bukulu (TMT10plex, inambala ya citabo 90110, iya basambi ba fya sayansi) ne cipimo ca fipimfya ku TMT ica 1:20. Pa kulemba TMT, 0.8 mg iya cibombelo ca TMT yalibweshiwe mu 70 μl iya ACN iyabula amenshi, kabili umuti wauma walibwekeshiwemo mu 9 μl iya 0.1 M TEAB (umuti wa TMT), uko 7 μl iya cibombelo ca TMT mu ACN yalibikwemo. Ukusansa kwali 43.75%. Pa numa ya maminiti 60 aya kupanga, ukucimfya kwazimishiwe na 2 μl iya 5% iya menshi ya menshi. Ama peptide ayalembelwe yasontelwe, yaumishiwe, yasuntinkanishiwe mu 200μl iya 0.1% iya asidi ya formic (FA), iyakanishiwa mu fiputulwa fibili, kabili lyene yafuminemo umucele ukubomfya ifishinka fya kupanga ifyaibela. Ukubomfya umusango wa menshi ayasuma nga nshi (UltiMate 3000 uwa maka nga nshi), cimo ica fiputulwa fibili caliputulwe pa cipimo ca 1mm x 150mm icaisulamo ifiputulwa fya C18 ifya 130Å1.7μm. Umusambi wa fya sayansi uwa mushili). Ukupaatukanya amapeptide pa cipimo ca kupongomoka ica 30μl/min, ukupaatulako ukufuma kuli 1% ukufika kuli 50% umuputule B pa maminiti 85 ne ciputulwa ca nshita ica maminiti 96, ukufuma pali 50% ukufika kuli 95% umuputule B pa maminiti 3, lyene amaminiti 8 pa 95 % Umuputule B; Iciputulwa ca A ni 5% ACN na 10 mM umulopa wa menshi (ABC), kabili iciputulwa B ni 80% ACN na 10 mM ABC. Ukulonganika ifiputulwa cila maminiti 3 no kufibika mu mabumba yabili (1 + 17, 2 + 18, na fimbi) no kufiuma mu cipe ca kufimbilikisha icabula umulilo.
Ukupitulukamo kwa LC-MS/MS. Pa kupima ubukulu bwa fipe, ama peptides (inambala r119.aq) yalipaatulwe pa 25 cm, 75 μm umupaka wa mukati uwa PicoFrit umulongo wa kufwailisha (lensi ipya iya kufwaya, inambala ya ciputulwa PF7508250) iyakwata 1.9 μm 1200 (Ifya sayansi ifya bashilika ba mu Germany). Iciputulwa ca nshita calisungilwe pa 50°C. Ifyakucingilila A na B ni 0.1% iya asidi mu menshi na 0.1% iya asidi mu 80% ACN, ukulingana. Amapeptide yalipaatulwe ne cipimo ca 200 nl/min ukufuma pali 6% ukufika kuli 31% icakucingilila B pa maminiti 65, kabili ukufuma pali 31% ukufika kuli 50% icakucingilila B pa maminiti 5. Ama peptide ayafuminemo yapitulwikwemo pa cipimo ca misango ya misango (Ifyakufwailako ifyakufwailako). Ukupima kwa m/z ukwa peptide kwacitwa ne cipimo ca 120,000 mu cipimo ca 350 ukufika kuli 1500 m/z. Ukubomfya 27% amaka ya kukansana ayalinga, umutuntulu uwa maka uwakwata umusango wa 2 ukufika kuli 6 asalwa ku maka yakalamba C ukukansana kwa mutego (HCD) ukukansana. Inshita ya kutendekelako yabikwa kuli 1 s. Umutengo wa m / z uwa ciputulwa ca peptide walipimilwe mu cishiba ca ion ukubomfya icipimo icinono ica AGC ica 5 × 104 ne nshita ya kucilikila iya 86 ms. Pa numa ya kupaatukana, ica kubalilapo cabikwe pa mulongo wa kukanshiwa uwa maka pa 45 s. Ama peptide ayalembelwe TMT yalipaatulwe pa 50 cm, 75 μm umulongo wa PepMap uwalumbanya (uwa sayansi uwa bashilika abapya, inambala ya citabo 164942), kabili imisango ya kusendama yapitulwikwemo pa cipimo ca misango ya misango ya fipimo fya fipimo fya fipimo fya fipimo fya fipimo fya fipimo fya fipimo fya fipimo fya fipimo fya fipimo fya fipimo fya fipimo fya fipimo fya fipimo fya fipimo fya fipimo fya fipimo fya fipimo) (FAIMS) ifibombelo (Ifyakufwailako ifyakusambilila ifyakupangapanga) fibomba pa maka yabili aya kulipila aya -50 na -70 V. MS3 iyasalilwe ukulingana ne cishinka ca kubalilapo ica kulinganya cibomfiwa ku kupima kwa cishibilo ca ion ica lipoti wa TMT. 1200, ukubomfya 90% ukufuuta kwa mulongo, ne cipimo ca buffer ica 6% ukufika kuli 31%; umuputule A wali 0.1% FA, kabili umuputule B wali 0.1% FA na 80% ACN. Iciputulwa ca kupitulukamo cibomfiwa pa 50°C. Ukubomfya umusango wa buntunse (umusango 1.6, uwa sayansi uwa bashimapepo) ku kwakanya failo wa kubalilapo ukulingana na maka ya kulipila aya FAIMS.
Ukuishiba amaproteini no kupima. Ukubomfya injini ya kufwailamo iya Andromeda iyabikwa pamo, amashiwi ya kubalilapo yapitulwikwemo ukubomfya umusango wa MaxQuant 1.5.2.8. Ukulunda pa mitantikile ya Cre na YFP iyasangilwe ukufuma ku Aequorea victoria, ifiputulwa fya fiputulwa fya peptide fyafwailwe pa mitantikile ya peptide iyalinga na imitantikile ya isoform iya cilangililo ca nkumba. Ukuwamya kwa methionine na ukuwamya kwa maproteini ukwa N-kulekelesha kwabikwe nge fya kwalula ifyapusanapusana; ukuwamya kwa cystein kwabikwe nga ukwalula ukwashintililwapo. Ifipimo fya kugaya ifya kulya fyabikwa pa “kulinga” na “trypsin/P”. Icipendo cacepako ica fipe fya kupangapanga ne fipe fya kupangapanga ifyabomfiwa ku kwishiba amaproteini ni 1; impendwa iinono iya ma peptide ayapusana ni 0. Mu mibele ya ma peptide ayapalana, umusango wa kwishibilako amaproteini wali 0.01. Iciputulwa ca “Peptide wa Bubili” calisuminishiwa. Bomfyeni “ukulinganisha pa kati ka mipepele” ukusalapo ukutwala ifishibilo fya kutunguluka pa kati ka ma fayelo ya kubalilapo ayapusanapusana. Bomfyeni LFQ umutengo uunono uwa kupenda 1 ku kupima ukwabula ukulemba (LFQ) (60). Ubukulu bwa LFQ bulasefiwa ukufika ku fipimo fibili ifyalinga ukufika kuli ibumba limo ilya genotype pa nshita imo imo, kabili bulafumishiwapo ukufuma ku kwakanya ukwalinga no bufumo bwa. 0.3 no kuya panshi 1.8. Ubomfye icifulo ca kompyuta ica Perseus () na R () ku kupituluka mu fyasangwa mu LFQ. Icilangililo ca t icalinga ica nshila shibili ukufuma ku cipe ca mapulogalamu ya limma cabomfiwe ku kufwailisha kwa misango yalekanalekana (61). Ukufwailisha kwa fishinka fyakufwailisha kulacitwa ukubomfya ggplot, ifyakupangapanga, ifyakupangapanga ifyalundwako, ifyakupangapanga ifyakupangapanga na ifyakupangapanga ifyakupangapanga. Amashiwi ayashintilila pa TMT yapitulwikwemo ukubomfya umusango wa MaxQuant 1.6.10.43. Ukufwaya ifyebo fya fimenwa ifishapangwa ukufuma ku citabo ca fimenwa ifya buntunse ica UniProt, icapokelelwe mu Sepitemba 2018. Ukufwailisha kwabikako ne cishinka ca kulungika ubusangu bwa isotope icapeelwe kuli bapanga. Bomfyeni limma mu R ku kupituluka mu mimonekele iyapusana. Amashiwi aya cine cine, ifyasangwa mu kufwaya kwa fishinka, no kufwailisha kwa fishinka ne fyasangwa fyonse fyasuminishiwa mu cilonganino ca ProteomeXchange ukupitila mu cifulo ca kusungilamo ifishinka ica PRIDE ne cishibilo ca fishinka PXD019690.
Amashiwi ayabomfiwa yalenga ukupitulukamo ukuwama. Icibombelo ca kufwailisha inshila ya mano (QIAGEN) cabomfiwe ku kwishiba ubunonshi bwa mashiwi ya kulondolola ayabomfiwa aya fishinka fyabikwa pa milungu 8 (Icikope 1). Mu kucefyako, umutande wa fipimo fya maproteini uwasangwa ukufuma ku LC-MS / MS (ukufwailisha kwa fipimo fya fipimo fya fipimo fya fipimo) ukufwailisha kwa fishinka kulabomfiwa ne fipimo fya kusefa ifikonkelepo: Umubili wa Mus wasalwa nga umusango ne ntulo, kabili umusango ulelanga umutengo wa P uwalungishiwa na Benjamini ku kunonsha 0.05 nelyo ukucepako kwamonwa ukuti kwalicindama. Pa cilangililo ici, ifiputulwa fisano ifya pamulu ifyacilapo muli cila cibumba ukulingana na mutengo wa P uwalungishiwa fyalangishiwa. Ukubomfya ukufwailisha kwa t ukwafulilako, ukubomfya ubupekanyo bwa kucincimusha ubwa kwa Benjamini, Krieger, na Yekutieli (Q = 5%), ukupitulukamo kwa ma protein ukwa nshita kulacitwa pa bakankaala abacindama abaishibikwa muli cila ciputulwa, kabili umulongo umo umo ulapitulwikwamo ukwapusana. Takuli ukukabila ukusumina SD iyakonkana.
Pa kuti tulinganishe ifyafuma muli ili isambililo ne fitabo fyapulintwa no kupanga icikope ca Venn mu cilangililo 1, twabikile pamo umutande wa fipimo fya maprotini ne fishinka fya MitoCarta 2.0 (24). Ubomfye icibombelo ca pa Intaneti ica kuti Lemba icikope ca Venn pa kuti ucite icikope.
Pa mashiwi ayatuntulu pa mibombele ya mipendelo iyabomfiwa ku kufwailisha kwa ma proteomics, mukwai moneni iciputulwa icalinga ica Ifibombelo ne Nshila. Pa fyakwesha fimbi fyonse, amashiwi ayatuntulu kuti yasangwa mu lyashi lya kale ilyapalana. Ukucila nga ca kuti calumbulwa fimbi, amashiwi yonse yalangishiwa nga ayalinga ± SEM, kabili ukupitulukamo konse ukwa fipendo kwacitilwe ukubomfya programu wa GraphPad Prism 8.1.2.
Pa lwa fishinka fyalundwapo ifya muli ici cipande, mukwai moneni pa Intaneti.
Ici cipande caishibikwa icasalanganishiwa ukupitila mu mafunde ya Citupa ca Kupanga-Icabula Amakwebo, icasuminisha ukubomfya, ukusabankanya no kupanga cipya cipya mu nshila iili yonse, nga ca kuti ukubomfya kwa kulekelesha te kwa kusanga indalama kabili icishinka ca kuti umulimo wa kubalilapo walilungama. Kuloshako.
Ishiba: Tulemulomba fye ukulemba akeyala kenu aka email pakuti umuntu uo mulepandako amano kwi buula aishibe ukuti mulefwaya ukuti amone email kabili te spam. Tatukakwate amakeyala ya email ayali yonse.
Ici cipusho cibomfiwa ku kwesha nga uli mutandashi no kucingilila ukutuma kwa spam ukwaibela.
Ukulembelwa na E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Larson
Ukufwailisha kwa ma protein aya fipimo fya mubili ifishibomba bwino kwasokolwele ukuti amaprogramu ya fya kulya yalebomba pa kulwisha ukubola kwa mubili.
Ukulembelwa na E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Larson
Ukufwailisha kwa ma protein aya fipimo fya mubili ifishibomba bwino kwasokolwele ukuti amaprogramu ya fya kulya yalebomba pa kulwisha ukubola kwa mubili.
©2020 Ibumba lya ku America ilya Kutungulula Sayansi. insambu shonse shasuminishiwa. AAAS ni cibusa wa kwa Hinari, Agora, Oare, KORA, CLOCKSS, Ukukonkana no Kupenda. Ukutunguluka kwa Sayansi 2375-2548.