Icifulo ca nomba line†Akeyala ka nomba line: OX11 0DE, UK, Icikuulwa ca Diamond, Icifulo ca Harwell ica Sayansi no Kupanga Ifya Kupangapanga, Icifulo ca Kusangwilako Ifya Bumi Ifya Bumi.
Iciputulwa ca nshita ica kulonganika ulubuuto 1 (RC-LH1) eciputulwa cikalamba ica bacteria abakwata ulubuuto ulwa pepo. Twatendeke imipangile ibili iya kumona ifintu ifinono ifya RC-LH1 ukufuma ku fimenwa ifinono ifya RC-LH1. Iciputulwa ca 2.65-Å ica RC-LH114-W cikwata ifiputulwa 14 ifya LH1 ifishinguluka RC, ifiputulwa na mapulotini W, lintu iciputulwa icabula amapulotini-W cakwata fyonse ifya RC ifyashingulukwa na RC. Ukufunga kwa fiputulwa 16 ifya LH1. Ukulinganisha kwa ifi ifikuulwa kulapeela amano ku mibele ya quinone mu RC-LH1, ukubikapo na ukwaluka kwa mibele ukwabula ukwishiba kale ilyo balebika quinone pa ncende ya RC QB, pamo pene ne ncende ya fifulo fya kwikata ifya kwafwilisha, ifikwafwilisha ukufitwala ku RC. Umusango wa pa lwakwe uwa protein wa W ulecingilila ukufunga kwa cipimo ca LH1, eico ukupanga inshila ya kucincimusha ukucinja kwa quinone / quinolone.
Amaka yapeelwa ne fyakupangapanga ifya kasuba kuti yasungilila ubumi bonse pano isonde, elyo yalikwata amaka ayakulu aya fyakupangapanga ifya kasuba. Nangu cakuti baletungilila ukupanga ifya kulya ifya kasuba mu calo conse, amabakitiliya aya purple ayalya ifya kulya fya kasuba nayo yalalanga imisango yalekanalekana iya maka na maka ya kupanga ifya kulya. Kuti fyacingililwa ku kupanga ifya kulya ifya kasuba no kukula nga ifibashi ifishakwata ifya kulya ifingi mu mfifi, kuti fyalungika umupashi wa menshi, ukupanga umupashi wa menshi, no konaula ifya kunwa ifya kunwa (1-3). Pa kuti ukupeela amaka kuli ifi fintu, ulubuuto lufwile ukupilibulwa bwangu kabili bwino mu maka ya kemikali. Iyi nshila itendekela ilyo umuputule wa antena uwakwata ulubuuto wakwata ulubuuto no kutwala amaka ayakwata ulubuuto ku cifulo ca kwasukapo (RC), eico ukutendeka ukulekanalekana kwa maka (4 – 7). Iciputulwa ca kubalilapo ica kupanga ifya kulya ifya kasuba mu bacteria aba peepo bakwata umusango wa 2 RC, uwashingulukwa ne ciputulwa ca kulonganika ulubuuto 1 (LH1), ukupanga iciputulwa ca RC-LH1 ica mu kati. LH1 yapangwa ne misango ya fimenwa ifyapusanapusana ifya αβ, cila cimo ica ifi fimenwa ifikakatika ifimenwa fibili ifya mishipa (BChl) na cimo nangu fibili ifya mishipa (8-12). Iciputulwa ca LH1 icayanguka sana cikwata ifiputulwa 16 nelyo 17 ifyashinguluka RC (9-13) mu ciputulwa cashinguluka, lelo mu fiputulwa fimbi ifya mu kati, amapeptide ayapita mu ciputulwa ca nshita yalepumfyanya ukutwalilila kwa ciputulwa ca nshita icashinguluka LH1 . 13-15). Icimenwa ica peepo ica kulya ifya kulya ifya kasuba (Rps.) cilangililo ca cimenwa icingaumfwikisha amaka no kutwala kwa kasuba ukwa kwafwilisha ukupanga ifya kulya ifya kasuba. Umusango wa kubalilapo uwa kristalo uwa Rps. Icilangililo ca RC-LH1 icapangwa ni RC, icashingulukwa ne fipimo 15 ifya LH1 ifyapusanapusana, ifiputulwa ne cipe icaishibikwa ica kuti “Icipe ca W” (14). Iciputulwa ca nshita icaishibikwa nga RPA4402, iciputulwa ca nshita ica 10.5kDa icakwata ifiputulwa fitatu ifyasobelwe ifya TMH (16). Tulefwaya ukupilibula ishina lya rpa4402 ilyakwata amaproteini W ukufika ku pufW pakuti lileumfwana ne shina lyabomfiwa ku fimenwa ifibika RC-L, M Ica kupapa, amaproteini-W yaba fye mupepi na 10% aya RC-LH1, ukusokolola Rps. icimenwa cipanga ifintu fibili ifyapusana ifya RC-LH1. Apa, tulelanda pa mipangilwe ya cryo-EM (cryo-EM) iya fipimo fibili ifyacindama, cimo icakwata amaproteini W na 14 αβ ifipusenepusene, cimbi icabula amaproteini W ne ciputulwa ca 16 ica LH1 icaisalilwa. Umusango wesu uleiminina ukwaluka kwa ntampulo mu kumfwikisha kwa RC-LH1 ukwa Rps. palustris, pantu twapitulwikemo mu cipendo ca misango imo imo kabili tuli no kupwisha ukwalinga ukwa kupeela bwino bwino cila cipimo ne fipimo ifibimbilwemo ne fipimo ifipaleneko ne fipimo ifipaleneko. Ukulinganisha kwa ifi fibumbwa kulangilila ukuti amaproteini yatatu aya TMH-W ayashisangilwe mu filonganino fimbi ifya RC-LH1 ukufika pali nomba yapanga inshila ya kucincintila ku kwangufyanya ukucinja kwa kucincintila / ukucincintila. Icipendo ca fifulo fyakubikamo amafuta na quinone fyasangwa, kabili twasokolwele ukwaluka ukupya ukwa mipangilwe panuma ya kusakanisha kwa quinone na RC, ifingalinga ku mibombele ya fikope II (PSII) RC iya fimenwa ifikwata umwela. Ifyo twasanga filapeela amano ayapya pa lwa mibele ya fimenwa ifyakwata amaka ya kupanga ifintu no kwalula mu RC-LH1 umutuntulu wa bacteria abakwata ifya kulya ifya pepo.
Pa kuti cibe icayanguka ukusambilila mubwipi pa fikuulwa fibili ifisangwa mu Rps. RC-LH1 umo umo ukupitila mu nshila sha fya mweo. Iciputulwa ca maprotini W-icabula (ukukonkapo ukuitwa ΔpufW) calisanguluka ukufuma ku musango uushakwata umusango wa pufW (16), kabili iciputulwa cimo fye ica RC-LH1 kuti capangwa. Iciputulwa ca protein W-icilimo cipangwa no musango. Amaproteini W aya uyu musango yapilibulwa ne cishibilo cakwe 10x pa mpela yakwe iya C, pakuti amaproteini W-ayakwata ifintu ifingi kuti yasankanishiwa bwino bwino na maprotini W ayabula ukupitila mu kucilikila ifyuma. Iciputulwa ca nshita calipaatukana bwino bwino (16) Ukupima kwa musango umo (IMAC).
Nga fintu calangililwa mu cilangililo 1, ifikuulwa fyonse fibili fyalikwata ifiputulwa fitatu ifya RC (RC-L, RC-M na RC-H) ifyashingulukwa ne ntumba ya LH1. Umusango wa 2.80-A uwa filonganino ifishakwata amaproteini-W ulelanga 16 αβ ifipusenepusene, ukupanga umuputule wa LH1 uwashinguluka RC, pano uleitwa ukuti icilonganino ca RC-LH116. Ubupangile bwa 2.65Å ubwa mapulotini-W-ayakwata ubusanso bwakwata amapulotini-W ayapusanapusana 14 ayaputulwa na mapulotini-W, pano ayaitwa RC-LH114-W.
(A na B) Ukuimikilila kwa pa muulu ukwa cilonganino. (C na D) Amabala ayasuntinkanishiwa ayalangishiwa mu mipeto. (E na F) Ifiputulwa ifimonwa ukufuma pa muulu wa citoplasma fyalikwata ama peptide na ifiputulwa ifinono ifya LH1 ifiimikwa mu fikope, kabili fyapendwa ukulingana ne nshita ukufuma ku ciputulwa ca protein-W [icalingana ne mpendwa ya Rba. ifiputulwa fya fiko (13)]. Pa lwa LH1-α, umusango wa ciputulwa ca maproteini uwa mutundu wa muntu wali uwa mutuntula; pa LH1-β, umusango wa ciputulwa ca maprotini wa buluu; pa lwa mapulotini-W, amapulotini yafiita; pa mulandu wa RC-H, ni cibumba; pa mulandu wa RC-L, ni Mutundu wa Muntu; pa RC-M, umutuntulu. Ifilenga ifintu ukuwama fimininako imikonko, ica katapa-katapa cimininako amamolekyu ya BChl na BPh, icabuuta cimininako amamolekyu ya carotenoids, kabili umutuntula uleimininako amamolekyu ya UQ10. (G na H) Ukumona ukwakulisha ukwa muputule wa maproteini-W mu citungu icalingana ica RC-LH114-W icakosa (G) na RC-LH116 icakosa (H). Ifyakupangapanga filangishiwa mu musango wa kuzusha umuputule, quinone iyapangwa ilalangishiwa mu buluu. Iciputulwa ca protein-W cilangishiwa no mushinku wa buluu uwaputulwa mu (G), ne fishima ifinono umo quinone / quinolol isansalikwa pa cipe ca LH116 cilangishiwa no mushinku wa buluu uwaputulwa mu (H).
Icikope 1 (A na B) cilanga RC iyashingulukwa ne fipe fyaisuka nelyo ifyashingulwikwa ifya LH1αβ ifyapusanapusana, cimo na cimo ica fiko cikakatika BChl shibili na carotenoid umo (Icikope 1, C na D). Amasambililo yapita yalanga ukuti Rps ni LH1 iyakosa. Mu nshila ya kupangamo ifya kulya ifya nyama, ifi fimenwa fyalikwata ifya kulya ifyapusanapusana (17). Na lyo line, umulopa wa mubili uwacilapo kabili ubufumo bwa uko bwalikumanina. Eico, twasalile ukupashanya umulopa pa fifulo fyonse ifya LH1. Iciputulwa ca nshita ica alpha na beta ni TMH imo ine iyakwata ifiputulwa fya kunse ifya fipimo ifipi (Icilangililo 1, A, B, E, na F). Nangu cakuti ubufuuke bwa fishalapo 17 pa mpela ya C tabwasangilwe, umusango wa alpha walipaatulwe ukufuma kuli Met1 ukufika kuli Ala46 mu fiputulwa fyonse fibili. β umubili uwafulilako walicefiwe ukufuma ku Gly4 ukufika ku Tyr52 mu RC-LH116, kabili ukufuma kuli Ser5 ukufika ku Tyr52 mu RC-LH114-W. Tapali ukufina kwa 3 nelyo 4 N-ukulekelesha nelyo 13 C-ukulekelesha ifishalapo ifyasangilwe (Icikope S1). Ukufwailisha kwa misango ya misango ya RC-LH1 iyasankanishiwa iyapekanishiwa ukufuma ku musango wa mpanga kwalangile ukuti icifulo icabulile cali ni cisuma icafuminemo mu kupaatukana kwa ifi fipe (Icilangililo S1 na S2). Ukupanga kwa N-ukulekelesha ukwa α-Met1 na ko kwamoneke (f). Ukufwailisha kwalangile ukuti α-peptide yalikwata ifishalapo fMet1 ukufika ku Asp42 / Ala46 / Ala47 / Ala50, kabili β-peptide yalikwata ifishalapo Ser2 ukufika ku Ala53, ifyo fyaumfwana bwino na mapu wa EM uwa mu kati uwacepa.
Ukubombela pamo ukwa α-Wakwe29 na β-Wakwe36 kulenga BChls ukumonana ku cinso; cila αβ heterodimer ilongana pamo na ba mupepi ba iko ku kupanga umuputule wa kwisula (RC-LH114-W) nelyo umuputule wa kwisalilwa (RC-LH116) ukushinguluka RC Umutande wa fipimo fya fipimo fya fipimo fya fipimo (Icikope 1, C na D). Ukulingana na 877 nm umutande wa RC-LH114-W, 880 nm ukusenda kwafiita ukwa RC-LH116 ni 3 nm (Icikope 2A). Nangu cibe fyo, umusango wa dichroism uwashinguluka walipalana (Icikope 2B), ukulanga ukuti nangu ca kuti kuli ubupusano bwaumfwika pa kati ka fipimo fyaisuka ne fyaisalilwa, icifulo ca mu ncende ya BChls calipalana nga nshi. Ukucimfya kwafiita ukwa kufimba kuti kwaba icafumamo ca kucefyako ukucincintila kwa mucinshi no kulunduluka kwa cipimo pa cipimo icaisalilwa (18, 19), ukwaluka mu kukumana kwa misango ya fipimo ukwaletwa ne cipimo icaisalilwa (20, 21), nelyo ukusanshako ifi fibili ififumamo (11).
(A) Iciputulwa ca nshita ica nshita ya ku nse / ica kumona / ica mupepi ne nshita ya ku nse, intanshi sha iko shalembelwe ne misango yabo iyalinga kabili iyalinga ukufika ku nsonsela sha BPh pa 775 nm. (B) Imisango ya misango ya misango iyashinguluka iyalinga ukufika ku BChl ukunwa pa 805 nm. (C na D) Imisango ya ΔA iyasalilwe ukufuma ku misango ya kupwisha iya nshita iya RC-LH114-W iyakosa (C) na RC-LH116 iyakosa (D). Pakulinganisha bwino, imisango yonse iyalinga kuli ∆A iya −A pa 0.2 ps. (E) Umusango wa c2 ukusansa pa numa ya kusansalikwa mu kubapo kwa misango yalekanalekana iya UQ2 (mona icikope S8 pa lwa fishinka ifishaishibikwa). (F) Mu maselo ayakuliile mwi samba lya lubuuto ulwacepa, ulwa pa kati nelyo ulwakulisha (10, 30 nelyo 300μMm-2 s-1, ukulingana), amaproteini W na RC-L ifiputulwa ifinono mu cifulo icasanguluka ne cipimo ca fipe ifyapusanapusana. Shininkisheni umusango wa ma protein ukupitila mu kufwailisha kwa SDS no kufwailisha kwa mubili (mona icikope S9 pa lwa fyebo ifipya). Shininkisheni umusango ukulingana na RC-LH114-W iyasanguluka. Ubupiina bwa RC-L ukufika ku mapulotini-W ayapusanapusana ni 1:1.
1, A, C, na E) bali mupepi no mupeela wa kubalilapo uwa RC (P) na 6.8 Å ukucila pa BChls iyalingana mu RC-LH116 (Icilangililo. 1, B, S3); 114-W na RC-LH116, inshita ya kucincimusha iya kutwala amaka ukufuma ku LH1 ukufika ku RC ni 40 ± 4 na 44 ± 3 ps (Icikope 2). , C na D, Icikope S4 na Ibula S2). Kabili tapali ubupusano ubukalamba mu kutwala kwa pa kompyuta mu kati ka RC (Icikope S5 ne filembo fyalundwako ifipaleneko). Tuletontonkanya ukuti ukulingana kwapalamisha ukwa nshita ya kutwala amaka pakati ka LH1 na RC-P ni pa mulandu wa kutali ukwapalana, angle na maka ya BChl ayengi mu fipimo fibili ifya LH1. Cilemoneka kwati ukufwailisha umusango wa maka ya LH1 ukufika ku cipimo icinono te kwayanguka ukucila ukutwala amaka ukufuma ku fifulo ifishalinga ukuya ku RC. Iciputulwa icaisulwa ica LH1 mu RC-LH114-W kuti na co capita mu kucincintila kwa mucinshi ukwacepako mu mibele ya mucinshi iyacepa ku kufwailisha kwa mipangilwe, kabili kuli ubutali bwa αβ14 ubwa mipeto pa mucinshi wa muputule ukufuma ku butali bwa βBChls pa cifulo ca RC 1.
Iciputulwa ca RC-LH116 cikwata ama BChls 32 na carotenoids 16, kabili ukutantika kwa ciko konse kwapalana ne fyo fyasangwa ukufuma ku cipe ca Thermochromatium (Tch.) pidpidum. (12) ne fisabo fya mu mpanga (10). Pa numa ya kulungatika, ukutamfiwa fye ukunono mu fifulo fya αβ ukwapusanapusana kwamoneke, maka maka 1-5, 15, na 16 (Icikope S6). Ukusangwa kwa protein-W kuli no kukwata ubupilibulo ubukulu pa mipangilwe ya LH1. Ama TMH ya iko yatatu yasuntinkanishiwa ku fipimfya ifipi, ne ciputulwa ca N ku lubali lwa lumen ulwa cilonganino ne ciputulwa ca C ku lubali lwa cilonganino (Ifikope 1A na 3, A ukufika kuli D). Iciputulwa ca maproteini-W cilakwata amenshi ayengi (Icilangililo 3B), kabili TMH2 na TMH3 balabomba pamo na LH1αβ-14 pa kupanga umuputule wa pa muulu (Icilangililo 3, B na E ukufika kuli G). Iciputulwa ca pa kati cisanshamo Phe, Leu na Val ifyashala mu citungu ca mu kati. Ifi fyashala fyabikwa pamo na ama amino asidi ayashikwata amenshi na αβ-14 amalangi. Ifishalapo fimo ifya ku nse nafyo filaafwako mu kulanshanya, ukusanshako ukubombela pamo ukwa hydrogen pakati ka W-Thr68 na β-Trp42 pa muulu wa cibumba icakosa (Icikope 3, F na G). Pa muulu wa cipindami, Gln34 ili mupepi ne bumba lya keto ilya αβ-14 iya fipindami fya mubili. Ukulundapo, umucila wa n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) walipwishiwe, kabili umucila wa iko uwafilwa ukupita mu menshi walifikile pa kati ka protein-W na αβ-14, kabili umucila wa mafuta kuti wasangwa mu mubili. Kabili twamwene ukuti ifiputulwa fya C-ifyakulekelesha ifya protein W na RCH fyalipalamisha nga nshi, lelo te mu cipimo ca kupanga ukulanshanya kwaibela (Icilangililo 1, A na E). Nalyo line, kuti kwaba ukumfwana mu fipimo fya C-ifyakulekelesha ifya ifi fipimo fibili, ifingapeela inshila iyakubomfya ifipimo-W mu nshita ya kulonganika kwa RC-LH114-W.
(A) Amaproteini-W, ayalungama ku cifulo ca LH1αβ14 mu musango wa fikope, yalikwata umunyololo wa lubali uwa musango wa nkonkoni (uwafiita), uwalangishiwa mu ciputulwa ca cilangililo ca maka ya maka (icifulo icafitulukila icafitulukila ne cipimo ca 0.13). (B) Amaproteini-W ayaimikwa ne mpanga iya mabala ayabula amenshi. Ififulo ifya polar ne fyakwata amaka filalangishiwa mu cyan, ififulo ifishakwata amenshi filangishiwa mu buuta, ne fifulo ifishakwata amenshi nga nshi filangishiwa mu orange. (C na D) Amaproteini-W ayaimikwa mu cikope, ukumoneka kwakwe kwapalana nga mu (A) (C), kabili yapilibulwa na 180° (D). Ukulingana na icifulo mu kukonkana, ifishalapo ifyapusana fipokelela umusango wa mabala ya mfula, apo umupaka wa N waba uwa buluu kabili umupaka wa C waba uwakashika. (E) Amaproteini-W mu kumona kumo kwine nga mu (A), ne fyashala pa ciputulwa ca maproteini-W:LH1 fyaimikwa ne mipeto iyakwata ifishibilo fyabikwako. (F) Amaprotini-W yapilibulwa 90° ukulingana na (E) na LH1αβ14 mu cilangililo ca katuni, kabili ukulingana na ifishalapo ifya pa kati mu cilangililo ca mipeto. Ifyashalapo ifya pa mulu ukufuma ku beta fyalembwa. Iciputulwa ca nshita cilangishiwa nge cimuti icalingana ne langi lya cilangililo 1, β-DDM iyaonaika ilangishiwa mu fitulukila, kabili umwela wa oxygen ulangishiwa mu nkanda iyafitulukila. (G) Ukumona mu (F) kwapilibulwa 180°, ne fyashala ifyaishibikwa ifya alpha ifyalembwa.
Amaproteini-W yapyana mu cifulo ca αβ iyapusana (iyalenga 15 mu cilangililo 1F), muli ifyo ukucingilila ukufunga kwa cipimo no kusendama kwa αβ ukwapusana kwatatu ukwa kubalilapo. Casangilwe ukuti ukutenteka kwakulisha ukwa αβ-1 ukwa kubalilapo ukulingana na filimu iyalinga kwali 25 ° ukufika kuli 29 ° (Icilangililo 1, A na E), icapangilwe na 2 ° ukufika kuli 8 ° ukutentemuka kwa αβ-1 mu RC A ukwapusana ukwakosa-LH116 na F (Icilangililo 1, B). Iciputulwa ca bubili na ica butatu ica misango yalekanalekana cisuntinkanishiwa pa 12° ukufika kuli 22° na 5° ukufika kuli 10°, ukulingana. Pa mulandu wa kukansana kwa RC, ukutenteka kwa αβ-1 takusanshamo umubili wa bubili uwa αβ (uuli uwapalana na αβ uwalenga 16 mu cilangililo 1F), eico ukupanga umupaka uwaumfwika mu cipe ca LH1 (Icilangililo 1, A na E) . Pa mulandu wa kubulwa kwa fipimo fibili ifya αβ, ukukonkana no kuonaula kwa fipimo fine ifya BChl na fibili ifya fipimo fya ku mubili, tapali nangu cimo ica fipimo fya ku mubili ifikuma ku ciputulwa ca αβ-1 icapilibuka, icalenga ukuti kube umupeto wa LH114-W uuli ne fipimo fya ku mubili 13 ifya nyama na 28 BChls. Ukupima kwa mu ncende ukwa fiputulwa fibili mu fitungu fya αβ1 ukufika kuli 7 kuli pa nshi ukucila ifyo ifyashalapo ifya LH1, ifingalanga ubupusano bwa cifyalilwa ubwa ciputulwa ca LH1 icapalamina ku ncende ya RC QB (Icikope 4) .
Ifikope fya RC-LH114-W (A na B) na RC-LH116 (C na D) fyalangishiwa ukufuma ku kumona kumo kwine ukwa pa muulu / ukumona kwa ku lubali (A na B) (A na C) na pa muulu wa cibumba ca Fig. Amakii ya mabala yalangishiwa ku kulyo.
Icilangililo cimbi fye ica mu kati icakwata umusango wa 1:14 ni cilya ica musango yo ica musango yo (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). Na lyo line, amaproteini W na PufX tayakwata ubupalamano ubumoneka, kabili yalikwata ubusuma ubukalamba pa mipangilwe yabo iya LH1. PufX ni TMH imo iyakwata umuputule wa N-uwa kulekelesha uwa mubili uubombela pamo no lubali lwa mubili ulwa RC-H (13) pa cifulo icalingana na Rps. ubulwele bwa nkumbabulili LH116αβ-16. PufX ipanga inshila iya kwalulamo umubili pakati ka RC-LH1 na umubili wa bcl kabili ilipo muli Rba yonse. ifiputulwa fya mu kati ifya fiko (13). Nangu cakuti ubutantiko bwa cimo-cimo buli mu Rba. Iciputulwa ca nshita ica RC-LH1-PufX cisangwa pa cifulo ca kufimbapo ica maprotini W mu RC-LH114-W, kabili umupaka uuletwa na PufX na maprotini-W uli pa cifulo icalinga (Icikope S7A). Umupaka mu RC-LH114-W na kabili walilingana ne nshila ya quinone iya kutontonkanyapo (8) iya Pseudomonas rosea LH1, iyo iyapangwa na ma peptide ayashipalana na protein W nangu PufX (Icilangililo S7B). Ukulundapo, umusebo wa quinone mu Blc. Iciputulwa ca LH1 icapangwa ukupitila mu kufumyamo iciputulwa cimo ica γ (7) cisangwa mu cifulo icapalana (Icikope S7C). Nangu cakutila cilatungililwa na ma protein ayapusanapusana, ukumoneka kwa ifi ifiputulwa fya misango misango mu cifulo cimo cine mu RC-LH1 cilemoneka nge ca kumwenako ca kwaluka ukwapalana, ukulanga ukuti umupaka uwapangwa na ma protein W kuti wabomba nge nshila ya misango yalekanalekana.
Umupaka mu ciputulwa ca LH114-W cisuminisha ukupanga iciputulwa ca cibumba icakonkana pakati ka cifulo ca mukati ica RC-LH114-W ne cibumba icikulu (Icilangililo 1G), ukucila ukusuntinkanya ifiputulwa fibili ukupitila mu ciputulwa ca mapulotini nga mu mapulotini. Iciputulwa ca RC-LH116 capalana ne Tch iyashingulwikwa. Iciputulwa ca musango wa nsonsela (22) (Icikope 1H). Ukutula apo ukusalanganya kwa quinone ukupitila mu cipe kwayanguka ukucila ukusalanganya ukupitila mu musebo wa protein uwacepa, ulupi lwa LH114-W ulwaisulwa kuti lwasuminisha ukupilibuka kwa RC ukwayanguka ukucila ulupi lwa LH116 ulwashingulwikwa, kabili ukusalanganya kwa quinone mu RC kuti kwacefiwa. Pa kwesha nga ca kuti umubili wa W ulakuma ukupilibula kwa fimenwa ukupitila mu RC, twacitile ukufwailisha kwa fimenwa pa cipimo cimo ica fimenwa 2 (UQ2) (umusango umo uwa UQ10 uwa cifyalilwa uwakwata umucila wa isoprene uwacepa) (Icilangililo 2E). Nangu ca kuti ukusangwa kwa quinone iyabikwamo kulacilikila ukushininkisha kwalungama ukwa cimonwa ca Michaelis ica lyonse (RC-LH114-W na RC-LH116 fyalinga kuli 0.2 ± 0.1 μM na 0.5 ± 0.2 μM, ukulingana), umutengo ukalamba uwa RC-LH114-0 28±5% ukucila pali RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Pa kubala twapingwilepo ukuti amaprotini-W yalipo mupepi na 10% aya muputule wa pa kati (16); pano, imitantikile ya kwikalamo iya maselo ya kukula ayacepa, aya pa kati, na ya pa muulu ni 15 ± 0.6%, 11 ± 1% na 0.9 ± 0.5, ukulingana % (Icikope 2F). Ukulinganisha kwa cipimo ca misango ya fimenwa kwalangile ukuti ukulundako kwa cishibilo ca fimenwa takwacefishe ubufulo bwa fimenwa-W ukulingana ne misango ya fimenwa (P = 0.59), kanshi ifi ifipimo te fyapangwa ifya fimenwa-W ifyapilibulwa (Icikope S10). Na lyo line, uku kucepa kwa ma protein-W mu cifulo ca RC-LH1 kuti kwasuminisha ba RC bamo ukupilibuka pa mushinku wa bwangu, eico ukucefyako ukucinja kwa kwangufyanya ukwa cipimo ca RC-LH116. Twamwene ukuti umusango wa lubuuto ulwakulisha tauleumfwana ne fyebo fya nomba line ifya kulemba, ifilanga ukuti ukusokolola kwa mutundu wa pufW kulakulilako mwi samba lya lubuuto lwa maka (Icikope S11) (23). Ubupusano pakati ka pufW ukulemba na mapulotini-W ukubikwa muli RC-LH1 ubupusano kabili kuti bwalangisha ukukonka kwa mapulotini ukwakosa.
Mu RC-LH114-W, 6 amafuta ya mutima (CDL), 7 amafuta ya mutima (POPC), 1 amafuta ya mutima (POPG) na 29 amamolekyu ya β-DDM yapeelwa no kupashanya muli yene 6 ama CDL, 24 ama POPC, 2 ama POPG na 12. Icikope 5, A na B). Mu mipangilwe iyi ibili, CDL mupepi no kuba ku lubali lwa cibumba, lintu POPC, POPG na β-DDM ifingi fyasangwa ku lubali lwa cibumba. Iciputulwa ca nshita ica RC-LH114-W (Icilangililo 5A), kabili fisano fyalipaatulwe mu citungu calinga ica RC-LH116 (Icilangililo 5B ). Amafuta ayengi yasangilwe ku lubali lumbi ulwa cilonganino, ukucilisha CDL, ayalonganikwe pa kati ka RC na αβ-7 ukufika kuli αβ-13 (Icikope 5, A na B). Amafuta yambi ayalungishiwa ne fyakufuuta fyasangwa kunse ya cipe ca LH1, kabili imitantikile ya acyl iyalungishiwa bwino ilafika pakati ka fiputulwa ifinono ifya LH1, iyatantikwa nga β-DDM mu RC-LH114-W, kabili iyalondolwelwa nga β-DDM mu RC ukusankanya kwa βPOPC-HDLDM na βPOPC-HD16. Ififulo fyapalana ifya kupanga amafuta ne fya kusamba mu mipangilwe yesu filalanga ukuti ni fifulo fya kufimba ifyalinga ifya ku mubili (Icikope S12A). Ififulo fya ma molekyulu ayalingana mu Tch nafyo fyalikwata ukulingana bwino. Ukutekanya kabili Trv. 970 RC-LH1s (Icilangililo S12, B ukufika kuli E) (9, 12) ne fyashala ifya kupanga ifya kupangapanga ifya mwi bumba lya mutwe wa lipid fyalangile ukusunga bwino bwino mu kulungatika kwa kukonkana (Icilangililo S13), ukulanga ukuti CDL iyasuminishiwa iyo ikwatanya ku RC (24), ifi fifulo kuti fyasuminishiwa.
(A na B) Amapeptide ya RC-LH114-W (A) na RC-LH116 (B) yaleimikwa ku fikope fya kupangapanga, kabili amapepala ya misango misango yaleimikwa ku mipeto, ukubomfya umusango wa mabala mu cilangililo 1. Amafuta yalangishiwa mu cikabilila, kabili ifya kusamba fyalangishiwa mu fiko. UQ iyapamfiwa ku fifulo fya RC QA na QB yaba iya mutuntula, lintu UQ iyapaatukana yaba iya buluu. (C na D) Imimwene imo ine nga (A) na (B), na mafuta yafuminemo. (E ukufika kuli G) Ukumona kwakulishiwa ukwa Q1 (E), Q2 (F) na Q3 (G) ukufuma ku RC-LH116, ne mipeto ya ku lubali iya kucincimusha umo na umbi. Amabond ya haidrojeni yalangishiwa nge mishilwa iyafiita iyaputulwa.
Mu RC-LH116, bonse babili RC QA na QB UQ, abasangwa mu kutwala kwa ma electron mu nshila ya kupaatulako amafuta, balabola mu fifulo fyabo ifya kufimbapo. Lelo, mu RC-LH114-W, QB quinone tayapwishishiwe kabili ikalandwapo mu kulungatika pe samba. Ukulunda pa fipe fya QA na QB, ifipe fibili ifya UQ (ifyasangwa pa kati ka fipe fya RC na LH1) fyapeelwa mu musango wa RC-LH114-W ukulingana na mabumba yabo aya mitwe ayalungikwa bwino (ayasangwa mu Q1 na Q2, ukulingana). umupaka). Icikope 5C). Amayuniti yabili aya isoprene yapeelwa kuli Q1, kabili mapu wa bufumo apwisha imicila 10 iya isoprene iya Q2. Mu cibumba ca RC-LH116, ifiputulwa fitatu ifya UQ10 ifyakwata umubili (Q1 ukufika kuli Q3, icikope 5D) fyalipwishishiwe, kabili ifiputulwa fyonse fyalikwata ubukata bwaumfwika mu mucila onse (Icikope 5, D ukufika kuli G). Mu mipangilwe ibili, ififulo fya mabumba ya mitwe ya quinone aya Q1 na Q2 fyalikwata ukulingana kwawama nga nshi (Icikope S12F), kabili filalanshanya fye na RC. Q1 ili pa mwinshi wa ciputulwa ca W ica RC-LH114-W (Icikope 1G na 5, C, D na E), kabili Q2 ili mupepi ne ncende ya kufimbapo iya QB (Icikope 5, C, D) na F). Iciputulwa ca L-Trp143 na L-Trp269 icasuminishiwa cili mupepi nga nshi na Q1 na Q2 kabili cipeela amaka ya π-ukubika pamo (Icikope 5, E na F, ne Icikope S12). L-Gln88, 3.0 Å ukufuma ku mwela wa kutali uwa Q1, upeela ubucibusa bwa maka ubwa haidrojeni (Icikope 5E); ici icashala cisuminishiwa mu RC shonse ukufumyako fye ubucibusa bwa kutali nga nshi (Icikope S13). L-Ser91 ilabikwa pa cifulo ca Thr mu fifulo fimbi ifingi ifya RC (Icilangililo S13), ni 3.8 ukufuma ku mwela wa methyl uwa Q1, kabili kuti yapeela amabumba ya hydrogen ayacepa (Icilangililo 5E). Q3 tailemoneka ukuba no kulanshanya ukwalinga, lelo ili mu citungu ca menshi pakati ka ciputulwa ca RC-M na ciputulwa ca LH1-α 5 ukufika kuli 6 (Icikope 5, D na G). Q1, Q2 na Q3 nangu ifipimo fyapalamisha ifyakupangapanga nafyo fyapwishiwa mu Tch. Umutembo, Trv. Umusango 970 na Blc. Iciputulwa ca nshita (9, 10, 12) cilanga icifulo ca kusunga ica kwafwilisha ica quinone mu cifulo ca RC-LH1 (Icilangililo S12G). 5.8 ± 0.7 iya cila ciputulwa icaishibikwa ukupitila mu kubomfya kwakulisha ukwa menshi ayaonaika (HPLC), lintu ama UQ yatatu ayaonaika mu RC-LH114-W yalicepa ukucila pa mutengo wapimilwe uwa 6.2 ± 0.3 (Icikope. icikuulwa.
Iciputulwa ca bufi ica L na M cila cimo cikwata ama TMH yasano kabili cipanga umusango umo uwa BChl, ifintu fibili ifya BChl, ifintu fibili ifya BChl, ne cimuti cimo icabula Heme na cimo nangu fibili ifya UQ10. Ukupitila mu kubapo kwa fibumba fya menshi pa mpela ya ketone no kulonganika kwa iko ukwaishibikwa mu Rps, ama carotenoids yasangwa mu ciputulwa ca M, iciitwa cis-3,4-ukufuuta amenshi. Imisango (25). Iciputulwa ca kunse ica RC-H cishintililwa pa cibumba na TMH imo. Umusango onse uwa RC walipalana ne fiputulwa fitatu ifya RC ifya misango iyapalana (nga Rba). ifiputulwa fya mubili (Icishibilo ca PDB: 3I4D). Iciputulwa cikalamba ica BChl na BPh, umusana wa carotenoid ne cimuti icishili ica heme filasansana mu kati ka fipimo fya ifi fibumba, nga fintu cicita ibumba lya mutwe wa UQ10 pa ncende ya QA na QB quinone pa RC-LH116 (Icilangililo S15).
Ukusangwa kwa mipangilwe ibili iya RC iyakwata imitantikile ya fifulo fya QB ifyapusanapusana kulapeela ishuko lipya ilya kufwailisha ukwaluka kwa mibele ukwakonkana no kuminkanya kwa QB quinone. Mu ciputulwa ca RC-LH116, umulopa wa QB uli mu cifulo ca “kupalamisha” icapamfiwa fyonse (26), lelo ukulekanalekana kwa RC-LH114-W takuli umulopa wa QB. Takuli umusango wa QB mu RC-LH114-W, icintu ica kupapa pantu iciputulwa ca nshita cilabomba, ukucila iciputulwa ca RC-LH116 icakwata umusango wa QB uwalungishiwa. Nangu cakuti ifipe fibili ifya LH1 fyalikwata ama quinone mutanda, fisano fyalyalwike mu cipe ca RC-LH116 icaisalilwa, lintu fye fitatu fyalyalwike mu cipe ca RC-LH114-W icaisuka. Uku ukukansana kwa mipangilwe ukwakulilako kuti kwalanga ukubweseshamo kwa bwangu ukwa fifulo fya RC-LH114-W QB, ukucincintila kwa bwangu ukwa quinone mu cifulo icakosa, no kulunduluka kwa mibele ya kwabuka umuputule wa LH1. Tulesosa ukuti ukukanakwata UQ mu cifulo ca RC QB ica RC-LH14-W kuti kwaba icafumamo ca cifulo cacilapo ukukosa kabili icacilapo ukubomba, kabili icifulo ca QB ica RC-LH114-W calipooselwe bwangu bwangu mu kwaluka kwa UQ Iciputulwa calinga (umulyango wa cifulo ca QB walishingulwikwe a uku kupanga) ref.
Nga takuli QB, ukushinguluka kwa L-Phe217 ukwakonkana ku cifulo icishili icalinga no kufimba kwa UQ10, pantu kukalenga ukusansa kwa mu ncende ne ciputulwa ca kubalilapo ica isoprene ica mucila (Icikope 6A). Ukulundapo, ukupilibuka kwakulisha ukwa mibele kwamoneka, maka maka helix de (helix iyipi mu ciputulwa ca pakati ka TMH D na E) apo L-Phe217 yasuntinkanishiwa ku cipe ca QB ica kufimbapo no kupilibuka kwa L-Tyr223 (Icilangililo 6A ) Ukuputula ukufimba kwa hydrogen ukwa M- icifulo (Icikope 6B). Helix ilapilibuka pa nshi ya iko, Cα iya L-Ser209 ilasuntinkanishiwa na 0.33Å, elyo L-Val221Cα yasuntinkanishiwa na 3.52Å. Takuli ukwaluka ukwamoneka mu TMH D na E, ifibikwa pa mulu mu fikuulwa fyonse fibili (Icikope 6A). Ukufika apo twaishiba, ici e cibumba ca kubalilapo mu RC ya cifyalilwa icaisala icifulo ca QB. Ukulinganisha ne mipangilwe iyakumanina (iya QB-iyasuntinkanishiwa) kulangilila ukuti ilyo quinone tailacefiwa, ukwaluka kwa mipangilwe kulafwaikwa pakuti ingile mu quinone. L-Phe217 ilapilibuka pa kupanga π-ukubika pamo ne bumba lya mutwe wa quinone, kabili helix ilapilibuka ukuya ku nse, ukusuminisha umubili wa L-Gly222 no lubali lwa L-Tyr223 ukupanga umutande wa menshi ayakwata umusango wa menshi ayashintilila (Icilangililo 6, A na C).
(A) Icilangililo ca pa mulu ica hologramu (umunyololo wa L, umunyololo wa muolife/M, umunyololo wa mutundu wa muntu) na apo (umunyololo wa mutundu wa muntu), umo ifishalapo ifishinka fikalamba filangishiwa mu musango wa kwimininako kwaba nge nkonkoni. UQ10 iimikwa ne cishibilo ca mutuntula. Umushila wa tudodo ulelanga ifibumba fya haidrojeni ifipangwa mu cibumba conse. (B na C) Ukuimikilila kwa pa muulu ukwa cipimo ca nshita yonse ica cibumba, ukulanga umupashi wa pa mbali uwa L-Phe217 mu buluu na L-Tyr223 mu cikashika, ukulingana. Iciputulwa ca L ca mfula; ifiputulwa ifinono ifya M na H tafyakwata amalangi. (D na E) Iciputulwa ca nshita ica RC QB [ibala lya (A) ukulingana] ne ciputulwa ca nshita ica PSII (icabuuta, ica buluu ne cibumba ca pulasitiki; ID ya PDB: 3WU2) Ukulinganisha (58).
Mukukanacetekela, nangula imipangile iingi iya QB-iyabula RCs ukwabula LH1 yalipo, ukwaluka kwa mibele ukwamoneke muli ili isambililo takwalandwapo kale. Ici cisanshamo umusango wa QB uwa kupwisha ukufuma ku Blc. (Icishibilo ca PDB: 3PRC) (27), Ukumona. (28) na Rba. (29), fyonse ifi mupepi no kulingana ne mipangilwe yabo yonse iya QB. Ukufwailisha kwapalamisha ukwa 3PRC kwasokolwele ukuti amamolekyu ya LDAO (amamolekyu ya fyakufuuta) yasuntinkanishiwa pa mwinshi wa cifulo ca QB, ici kuti cacingilila ukubweseshamo mu cifulo icaisalilwa. Nangu ca kuti LDAO tayabola pa cifulo cimo cine mu 1EYS nelyo 1OGV, ifi RCs fyapekanishiwa ukubomfya umuti umo wine uwa kusamba kabili eico kuti fyapanga ifya kufumamo fimo fine. Umusango wa kristalo uwa Rba. Iciputulwa ca RC icapangwa pamo na c2 (PDB ID: 1L9B) na co cilemoneka ukuba ne ncende ya QB iyaisalilwa. Nangu cibe fyo, muli iyi nshita, iciputulwa ca N-ica kulekelesha ica RC-M (ukulanshanya ne cifulo ca QB ica kufimbapo ukupitila mu cipe ca H ica Tyr icashala pa Q helix) cipokelela umusango uushaba uwa cifyalilwa, kabili ukwaluka kwa musango wa QB takufwailisha na fimbi (30 ). Icashininkisha ca kuti tatumwene uyu musango wa kuonaika kwa M polypeptide mu cibumba ca RC-LH114-W, icapalana ne citungu ca N-kulekelesha ica RC-LH116 RC. Kabili cifwile ukwishibikwa ukuti pa numa ya kupwisha umusango wa LH1 uwashintilila pa fya kusamba, ama RC ya apolipoprotein mu PDB yalipwishishiwe, icafumishepo ifishima fya mukati ifya quinone na mafuta mu ciputulwa ca pa kati ka RC ne mpanga ya mukati iya cipe ca LH1 icashinguluka (31, 32). RC itwalilila ukubomba pantu ilasunga ifilenga fyonse ukubomba, ukufumyako fye quinone iya QB iyaonaika, iyo iyacepa kabili ilingi line ilaonaika mu nshita ya kupekanya (33). Ukulundapo, calishibikwa ukuti ukufumyapo LH1 na mafuta ya cifyalilwa aya muputule ukufuma ku RC kuti kwaba no busanso ku milimo, pamo nga ukucefyako ubumi bwa P + QB-umutundu uwapusanapusana (31, 34, 35). E ico, tuletontonkanya ukuti ukubako kwa cipe ca LH1 ica mu ncende icashinguluka RC kuti kwasunga icifulo ca QB “icaisalilwa,” muli ifyo ukusunga icifulo ca mu ncende mupepi na QB.
Nangu ca kutila apolipoprotein (ukwabula QB quinone) ne mipangilwe yonse ifimininako fye ifikope fibili ifya kupilibula kwa cifulo ca QB, ukucila pa fishinka ifingi ifyacitika, kuli ifilanga ukuti ukuminkanya kuti kwacingililwa ku kucilikila ukuminkanya na kabili ku hydroquinone Ukucingilila ukukansha kwa cipimo. Ukulanshanya kwa quinolol na quinone mupepi ne ncende ya QB iya fimenwa ifinono kuti kwaba ukwapusana, ukutwala ku kukaana kwa iko na RC. Casoselwe kale ukuti ukwaluka kwa mipangilwe kulabomba umulimo mu kwikata no kucefyako ama quinones. Ukufikapo kwa RCs iyafiita ukucefyako ama quinones pa numa ya kuitemenwa kwa mfifi kwaonaika (36); Ukufwailisha kwa X-ray kulalanga ukuti uku konaula kwaba pa mulandu wa kuti ifipe fya QB fyalibikwa mu cifulo ca “kutali” ica mupepi na 4.5 Å ukufuma ku cifulo ca mupepi icabomba (26) , 37). Tulesosa ukuti uku kupanga ukuminkanya kwa kutali ni cimpashanya ca mibele ya pakati ka apolipoprotein na mipangilwe ya cipe conse, iyo ikonka ukulanshanya kwa kubalilapo na quinone no kwisula incende ya QB.
Umusango wa II RC uwasangwa mu PSII uwa fibashi fimo ifya kulya ifya kulya ifya kasuba ne fibashi fya mu menshi, amabuula ya menshi ne fimenwa fyalikwata ukusunga kwa mipangilwe ne milimo (38). Ukulingana kwa mipangilwe ukwalangishiwa mu cilangililo 6 (D na E) kushininkisha ukupalana pakati ka PSII RCs ne ncende ya QB iya RC iya bacteria. Uku kulinganya kwaba kale ica kumwenako ca kusambililamo inshila shapalana isha quinone ukuminkanya no kucefyako. Amabuuku yapita yasosele ukuti ukwaluka kwa mibele kulakonkana no kucefyako kwa PSII ukwa fipe fya kufwala (39, 40). Eico, ukutontonkanya pa kusungililwa kwa RC, iyi inshila iyabikwamo iyaishibikwe kale kuti yabomfiwa na ku ncende ya QB iya PSII RC mu fimenwa ifyakwata umwela.
Rps ΔpufW (ukufumyapo kwa pufW ukwabula icishibilo) na PufW-Ifyakwe (C-ukulekelesha 10x Ifyakwe-Ifyakwe-Ifyakwe ifyalangishiwa ukufuma ku cifulo ca cifyalilwa ica pufW) imisango. CGA009 yalondolwelwe mu mulimo wesu uwapita (16). Iyi misango no mufyashi wa musango umo uwa mu mpanga fyasangilwe ukufuma ku cipe ca kufimbilikisha ukupitila mu kufimba impendwa iinono iya maselo pa PYE (cila lita 5 g -1) (ayasungwa mu LB pa -80 °C, ayakwata 50% (w / v) umukaka wa glycerol, umukaka wa citutumusi na umukaka wa cifuba. Ici cipe calipooselwe ubushiku bonse mu mfifi pa muputule wa kufimbilikisha, kabili lyene calipooselwe ulubuuto ulubuuta (~50 μmolm-2 s-1) ulwapeelwe na OSRAM 116-W amabulbu ya halogen (Ifiputulwa fya RS, UK) pa nshiku 3 ukufika kuli 5 ukufikila icilonganino cimo camoneke. Iciputulwa cimo ica mpanga cabomfiwe ku kusanshamo 10 ml iya M22+ iyalinga (41) iyalundwako na 0.1% (w / v) iya asidi ya casamino (ukufuma pano ukuitwa M22). Ici cimenwa cakuliile mu mibele ya oxygen iyacepa mu mfifi pa 34°C no kukunkuma pa 180 rpm pa maawala 48, kabili lyene 70 ml iya cimenwa calipooselwe mu mibele imo ine pa maawala 24. Iciputulwa ca nshita ica 1 ml cibomfiwa ku kusanshamo 30 ml iya M22 mu kati ka 30 ml iya cipe ca gilasi ica pa muulu ica 30 ml kabili icasansalikwa no kusansalikwa (~ 50μmolm-2 s-1) pa maawala 48 ukupitila mu maka ya magneti ayabula ubumi. Lyena 30 ml iya cimenwa yalipooselwemo mupepi na lita imo iya cimenwa mu mibele imo ine, iyo lyene yabomfiwe ku kusendwa mupepi na lita 9 iya cimenwa iyabengelwe pa ~200 μmolm-2 s-1 pa maawala 72. Ama cell yasontelwe ukupitila mu kusendwa pa 7132 RCF pa maminiti 30, ukubweseshiwamo mu ~ 10 ml iya 20 mM tris-HCl (pH 8.0), no kusungwa pa -20 ° C ukufikila cakabilwa.
Pa numa ya kusungulula, ulenge amakristalo yamo aya kupanga umubili (Merck, UK), umubili wa lysozyme (Merck, UK) na mapilisi yabili aya kupanga umubili uwa Roche (Merck, UK) ku maselo ayasuntinkanishiwa. Mu cipe ca ku France ica kucincimusha ica 20,000 psi (Aminco, U.S.A.), ifipe fyaonawilwe imiku 8 ukufika kuli 12. Pa numa ya kufumyapo ama cell ayashiputuka ne fisoso ifishasunguluka ukupitila mu kufimba pa 18,500 RCF pa maminiti 15 pa 4°C, umuputule wa pa nshi walipooselwe ukufuma ku lysate iyafimbwa ukupitila mu kufimba pa 113,000 RCF pa maawala yabili pa 43,000°C. Ukusuula iciputulwa icasunguluka no kubwesha umuputule wa mabala muli 100 ukufika kuli 200 ml iya 20 mM tris-HCl (pH 8.0) no kupanga ukulingana ukufikila takuli ifilonganino ifilemoneka. Iciputulwa ca nshita icaimikwa calibikwe mu 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Umusambo wa Amerika) uwakwata 2% (w / v) β-DDM pa ora limo mu mfifi pa 4 ° C no kucincimusha ukwayanguka. Lyena fumyeni pa 70°C ukusungulula 150,000 RCF pa 4°C pa ora limo ku kufumyapo ifyashala ifishasunguluka.
Iciputulwa ca nshita ica 50 ml DEAE Sepharose ion ukupilibula umulongo ne misango itatu iya milongo (CV) iya buffer ya kukakatika [20 mM tris-HCl (pH 8.0) iyakwata 0.03% (w / v) β-DDM]. Ukusamba umuputule ne fipe fibili ifya CV ifya kufwala, kabili lyene ukusamba umuputule ne fipe fibili ifya kufwala ifyakwata 50 mM NaCl. Iciputulwa ca RC-LH116 califumishiwepo ne cipimo ca mulongo ica 150 ukufika kuli 300 mM NaCl (mu cipimo ca kufimbapo) pa 1.75 CV, kabili ica kufimbapo icashele cafuminemo ne cipimo ca kufimbapo icali na 300 mM NaCl pa 0.5 CV. Ukulonganika umusango wa kunwa pa kati ka 250 na 1000 nm, ukusunga iciputulwa ne cipimo ca kunwa (A880/A280) ukucila pali 1 pa 880 ukufika kuli 280 nm, ukucifuuta imiku ibili mu cipe ca kufimbapo, no kubomfya inshila imo ine na kabili pa mushinku wa DEAE Pa kusangulula. Ukucefyako ifiputulwa ifyakwata imisango ya A880/A280 ukucila pali 1.7 na A880/A805 ukucila pali 3.0, ukucita umutande wa butatu uwa kwalula kwa ion, no kusunga ifiputulwa ifyakwata imisango ya A880/A280 ukucila pali 2.2 na A880/A805 ukucila pali 3.0. Iciputulwa icasanguluka icabikwa pamo ukufika kuli ~2 ml mu Amicon 100,000 ubukata bwa molekyulu ubwaputulwa (MWCO) ukusefa kwa pa kati (Merck, UK), no kubikwa pa cipimo ca Superdex 200 16/600 icakufumyamo ica mulongo (GE Healthcare, US) icakwata umukaka wa 200 m 1.5 Icitabo Ukulonganika imisango ya kunwa iya ciputulwa ca bukulu ica kulekelesha, no kubika amano ku misango ya kunwa ne misango ya A880 / A280 ukucila pali 2.4 na A880 / A805 imisango ukucila pali 5.8 ukufika kuli 100 A880, kabili bwangu bwangu bomfyeni ku kupekanya kwa grid ya cryo-TEM nelyo ukusunga ukukabila Ukusunga pa -8°C.
Iciputulwa ca nshita ica kufuma ku PufW-Umusango wakwe cabomfiwe ku 20 ml iya nshita ya ku numa (20 mM tris-HCl (pH 8.0) iyakwata 200 mM NaCl na 0.03% (w / w)) mu IMAC buffer (GE). v) ubupiina bwa bufi]. Iciputulwa ca nshita casambilwe na ma CV yasano aya IMAC, kabili lyene na ma CV yasano aya IMAC ayakwata 10 mM iya menshi. Iciputulwa ca mu kati cafumine pa cipimo ne fipe fisano ifya IMAC ifyakwata 100 mM iya miti ikola. Iciputulwa ca RC-LH114-W icakosa cibikwa pamo ukufika kuli ~10 ml mu cipe icasansalikwa icakwata icipe ca kusefa ica Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK), icasansalikwa imiku 20 ne cipe ca kufimbapo, kabili lyene icabikwako ku 25 ml ica kufimbapo ica kufimbapo. pa ntanshi. Ukusamba umulongo ne fipe fine ifya kufimbapo ifya CV, lyena ukufumyapo ifipe pa CV cinekonsekonse pa mushinku wa 0 ukufika kuli 100 mM NaCl (mu cipe ca kufimbapo), kabili ifipe fine ifya kufimbapo ifyashala ifyakwata ifipe fya kufimbapo ifya 100 mM Ifipe fya kufimbapo ifyashala fyafumine pa so8A2. 100,000 MWCO, kabili fyaiswilemo 1.5 CV IMAC mu ntanshi Icipe calinga ica Superdex 200 icabikwamo mu 16/600. 1.5 Icitabo Ukulonganika imisango ya kunwa iya fiputulwa fya bukulu-ukufumyamo no kubika amano ku misango ya kunwa na A880 / A280 imilinganine ukucila pali 2.1 na A880 / A805 imilinganine ukucila pali 4.6 ukufika kuli 100 A880, iyo ibomfiwa bwangu bwangu ku kupekanya kwa TEM ukwakosa nelyo ukusungwa pa -80.
Icipe ca Leica EM GP ica kufimbilikisha icabomfiwe ku kupekanya amagridi ya TEM ayacepa. Iciputulwa ca IMAC calipooselwe mu cipe ca IMAC ukufika kuli A880 ica 50, kabili lyene 5μl calipooselwe pa cipe cipya icafuminemo ica mukuba icabikwapo umukuba (Ifya sayansi ifya Agar, UK). Ukufuuta umushili pa 20°C na 60% umutonshi uwalinga pa ma s 30, lyena ukuuuma pa ma s 3, elyo no kuuzima mu menshi ya ethane pa -176°C.
Ilyashi lya RC-LH114-W lyalembelwe pa eBIC (Icifulo ca Kufwailishishamo Ifya Bumi) (Intuntuko ya Lubuuto lwa Diamondi iya ku Britain) ne cipe ca kumona ifintu ifinono ica Titan Krios, icibomba pa maka ya bwangu aya 300kV, ne cipimo cakulisha ica maka ya 130,000 aya-V na Icipe ca GIF ica Gatan 968 icakwata ica kufwailako ica K2 cabomfiwe ku kulemba ifikope mu nshila ya kupenda pa kulonganika amashiwi. Ubukulu bwa pixel ubupimilwe ni 1.048Å, kabili umusango wa miti ni 3.83 e-Å-2s-1. Ukulonganika filimu mu masekondi 11 no kuiputula mu fiputulwa 40. Bomfyeni icifulo icabikwamo carbon ku kubweshapo ukumona ifintu ifinono, kabili lyene ukulonganika ifilimba fitatu pa cishima cimo cimo. Mukulonganika, amafilimu 3130 yasontelwe, ne mibele ya kufilwa ukumona pakati ka -1 na -3μm.
Amashiwi aya pa RC-LH116 yasontelwe ukubomfya icikope cimo cine icakumona ifintu ifinono pa cifulo cakupiminamo ifyakupangapanga ifya mweo (Isukulu lya Leeds, UK). Amashiwi yasontelwe mu nshila ya kupenda ukubomfya ukukulisha kwa 130 k, kabili ubukulu bwa ma pixel bwapimilwe ukufika kuli 1.065 Å ne cipimo ca 4.6 e-Å-2s-1. Filimu yalembwa muli masekondi 12 kabili yalipaatulwe mu fiputulwa 48. Mukulonganika, amafilimu 3359 yasontelwe, ne mibele ya kufilwa ukumona pakati ka -1 na -3μm.
Ukubomfya kwa fishinka fyonse kulacitwa mu mupaipi wa Relion 3.0 (42). Ukubomfya ukucincintila 2 (43) ku kulungika ukucincintila kwa cimuti ukupitila mu kupima ubupiina, kabili lyene bomfyeni CTFFIND 4.1 (44) ku kwishiba umusango wa CTF (umulimo wa kutwala ukwapusana). Ifikope ifinono ifyalinga panuma ya ifi ifiputulwa fya kubalilapo ifya kupanga filangishiwa mu cilangililo 2. S16. Icilangililo ca kusalapo icaibela cipangwa ukupitila mu kusalapo kwa ku minwe mupepi na ma pixel 250 aya fipimfya 1000 mu cipimo ca ma pixel 250 kabili tapali ukulangilila ukusalulula kwa misango ibili (2D), muli ifyo ukukaana ukusalulula ukwakumana no kuonaula kwa cilangililo nelyo ukwabula imibele iyaishibikwa. Lyena, ukusalapo kwa kuitemenwa kwacitilwe pa fikope fyonse ifinono, kabili RC-LH114-W yali ifiputulwa 849,359, kabili ifiputulwa fya RC-LH116 fyali ifiputulwa 476,547. Ifiputulwa fyonse ifyasalilwe fyapitile mu milungu ibili iya kusalulula kwa 2D ukwabula ukukonka, kabili pa numa ya kubutuka konse, ifiputulwa ifikumana ne ncende ya carbon, ukubifya kwa cilangililo, tapali ifintu ifimoneka nelyo ifiputulwa ifyacilapo ukusansalikwa nga nshi fyakanishiwa, icalengele ukuti 772,033 (90.9%) na 359,678 ifiputulwa fibomfiwa pa kusansalikwa. RC-LH114-W na RC-LH116 ukulingana. Icilangililo ca 3D icakubalilapo capangilwe ukubomfya inshila iyakukonkapo iyakukonkapo. Ukubomfya umusango wa kubalilapo nga ca kumwenako, ifiputulwa fyasalilwe fyalibikwa mu fiputulwa fine mu 3D. Ukubomfya icilangililo muli ici ciputulwa nga ca kumwenako, citeni ukuwamya kwa 3D pa fipimfya mu ciputulwa icikulu, lyene bomfyeni ica kubalilapo 15Å ica kufimbapo ica kucefyako ukufimba icifulo ca kufimbapo, ukulundako ama pixels 6 aya mipeto iyakunkuma, kabili pa numa ya kupanga ama pixels ku kulungika ukupilibula kwa pa muulu ukwa Gatan K2 ukufumyapo umulimo wa Mo. Pa lwa fipekanyo fya RC-LH114-W, ici cilangililo ca kubalilapo calyalwilwe ukupitila mu kufumyapo ubukata bwa maka pa mpela sha cipe (ukwaputulwa ukufuma ku bukata bwa mu kati mu UCSF Chimera). Imisango iyafumamo (amasuko ya RC-LH114-W na RC-LH116 ni 3.91 na 4.16 Å, ukulingana) ilabomfiwa nge cilangililo ca ciputulwa ca bubili ica kwakanya kwa 3D. Ifiputulwa fyabomfiwa fyabikwa mu mabumba mu ciputulwa ca kubalilapo ica 3D kabili tafyakwata ukumfwana kwakosa no mushi. Ukucilapo nelyo ukukanakwata ifintu ifimoneka ifya mipangilwe. Pa numa ya ciputulwa ca bubili ica kwakanya 3D, umusango uwali ne cipimo cakulisha walisalilwe [Kuli RC-LH114-W, umusango umo ni 377,703 ifiputulwa (44.5%), ku RC-LH116, pano kuli ifiputulwa fibili ilyo fye ifiputulwa 260,752 fyalilungama. pa numa ya kutendekelako ukupilibuka no kupusana ukunono]. Ifiputulwa fyasalilwe filafumishiwapo na kabili mu kabokoshi ka ma pixel 400 no kusangululwa ukupitila mu kusangululwa kwa 3D. Icipe ca kufimbapo ica kusungusha cipangwa ukubomfya ica kutendekelako ica 15Å ica kufimbapo icacepako, ukusansa kwa mapu ya ma pixel 3 ne cipe ca kufimbapo ica ma pixel 3 icakunkumuka. Ukubomfya ukuwamya kwa CTF pa ciputulwa cimo na cimo, ukulungika ukucincintila kwa ciputulwa cimo na cimo no muputule wa bubili uwa kulungika kwa CTF pa ciputulwa cimo na cimo, ukuwamya kwa 3D, ukufimba kwa solvent no kupanga pa numa kulacitwa pa numa ya cila nshita ku kulundulula ukuwamya kwa musango wafumamo. Ukubomfya FSC (Icipimo ca Kukonkana ica Cipe ca Kukonkapo) umutengo wa kucefyako uwa 0.143, amasuko ya misango ya kulekelesha iya RC-LH114-W na RC-LH116 ni 2.65 na 2.80Å, ukulingana. Iciputulwa ca FSC ica cilangililo ca kulekelesha cilangishiwa mu cilangililo 2. S17.
Ukukonkana kwa maproteini yonse kwafumine ku ciputulwa ca nshita ica nshita ya ku ntanshi; LH1-α (Ukufuuta; Icishibilo ca Bumo: Q6N9L4); RC-L (Ukufumyapo; Icishibilo ca Bumo: O83005); RC-M (Ukufumyapo; Icishibilo ca Bumo: A0A4Z7); RC-H (Iciputulwa ca Bumo: A0A4Z9); Iciputulwa ca maproteini-W (Iciputulwa ca maprotini: Q6N1K3). Icilangililo ca Swiss (45) cabomfiwe ku kupanga icilangililo ca RC icapalana, icakwata imitantikile ya maprotini aya RC-L, RC-M na RC-H ne mipangilwe ya Rba. RC yabomfiwe nga cilangililo (PDB ID: 5LSE) (46). Ukubomfya icibombelo ca “mapu walinga” mu UCSF Chimera ku kulinganya umusango wapangilwe kuli mapu (47), ukuwamya imipangile ya mapulotini, no kupanga [4×BChl a (ishina lya fishalapo ifya citabo cimo = BCL), 2×BCh a (BPH), umusango umo nelyo ibili uwa UQ10 (U10), umo uushaba he) 3,4-ukubomfya Coot (48) ku kulundapo. Apo QAK tayasangwa mu citabo ca fitabo, yalipiminwe ukubomfya icibombelo ca eLBOW mu PHENIX (49).
Pa numa, iciputulwa ca LH1 cakuulwe. Pa kubala, icibombelo ca kukuula icaibela mu PHENIX (49) cabomfiwe ku kupanga iciputulwa ca LH1 icakonkana ukubomfya mapu na LH1-α na LH1-β ukukonkana kwa maproteini nge fyakubikamo. Saleni iciputulwa ca LH1 icapwililika nga nshi, cifumyeni no kucibika mu Coot, mu kuboko ukulundako ukukonkana ukwabulile muli ci, kabili mu kuboko ukuwamya umusango onse ilyo tamulabikapo BCls shibili a (BCL) na CRT [ukulingana na Rps iyalinga Ubufuuke bwa LH1 ubusanso bwa caroten ne fyaishibikwa. Imisango (17)]. Kopa iciputulwa ca LH1 icakumanina, kabili bomfyeni “Icibombelo ca Mapu ya Kubikapo” ica UCSF ku kufikapo mu cifulo ca mupepi icabula ica kumwenako ica bufumo bwa LH1, kabili lyene ukucilungisha mu Coot; bwekeshapo inshila ukufikila ifiputulwa fyonse ifya LH1 fyapangwa. Pa mipangilwe ya RC-LH114-W, ukupitila mu kufumya ubufuuke ubushapeelwa muli Coot, amaproteini yaputulwa ukufuma ku fiputulwa ifishalapo ifya mapulotini muli mapu wa USCF Chimera elyo ne cibombelo cakupanga icakupanga cibomfiwa ku kupanga umusango wa kubalilapo, na ifiputulwa ifinono ifyashala (amaproteini-W) Ukupanga. Mu cikuuku (49). Lundako imitantikile yonse iyabula ku cilangililo icafumamo mu Coot (48), elyo no kulungika iciputulwa conse. Iciputulwa ca nshita icashala icabula ukupeelwa cilalinga ukusankanya kwa mafuta (PDB ID ya CDL = CDL, POPC = 6PL na POPG = PGT), umuti wa β-DDM (LMT) na UQ10 (U10). Bomfyeni ukuwamya kwa PHENIX (49) no kuwamya kwa mu minwe mu Coot (48) ku kupwisha umusango wa kubalilapo uwakumanina ukufikila imitantikile ya musango no kumona kwalinga te kuti fiwamyeko na fimbi. Mukulekelesha, bomfyeni LocScale (50) ukuwamya mapu wa cikaya, elyo no kucita imiku iingi iya kupanga ubufuuke ubushapeelwa no kulungika ukwaibela no kwakubomfya amaboko.
Ama peptide ayapusanapusana, ifibombelo fimbi na fimbi ifya mafuta na fimbi ifyabikwa mu kati ka fipimo fyafiko fyalangishiwa mu fikope 1 na 2. S18 ukufika kuli S23. Amashiwi ya mipendelo aya cilangililo ca kulekelesha yalangishiwa pa Ibula S1.
Ukucila nga ca kuti calumbulwa fimbi, imisango ya UV / Vis / NIR iya kusendama yasontelwe pa cipimo ca Cary60 (Agilent, USA) pa kati ka 1 nm ukufuma pali 250 nm ukufika kuli 1000 nm ne nshita ya kulonganika iya 0.1s.
Ukufuuta icilangililo mu cipe ca mabwe ayakwata inshila ya 2 mm ukufika ku A880 iya 1, no kulonganika umusango wa kunwa pakati ka 400 na 1000 nm. Imisango ya misango ibili iyashinguluka yasontelwe pa cipimo ca misango ya misango iya Jasco 810 (Jasco, Japan) pa 1 nm pakati ka 400 nm na 950 nm pa cipimo ca 20 nm min-1.
Iciputulwa ca kupwisha kwa molar cimonwa ukupitila mu kucefyako umusango wa mu kati ukufika kuli A880 uwa mupepi na 50. Ukucefyako ubukulu bwa 10μl mu 990μl iya kufimbapo nelyo methanol, no kulonganika umusango wa kunwa bwangu bwangu ku kucefyako ukuonaika kwa BChl. Iciputulwa ca BChl ica cilangililo cimo na cimo ica methanol calipendelwe ukupitila mu cipimo ca kupwa pa 771 nm ica 54.8 mM-1 cm-1, kabili icipimo ca kupwa caishibikwe (51). Apaatuleni ubupimo bwa BChl ubwapimilwe na 32 (RC-LH114-W) nangu 36 (RC-LH116) pakuti mwishibe ubukulu bwa fipimo fya mu kati, ifyo lyene fibomfiwa ku kwishiba umusango wa kunwa uwa cilangililo cimo cine icalonganikwa mu cipimo ca kupwisha ica buffer. ukupalana. Imipikile itatu iyabwekeshiwapo yasendelwe kuli cila cilangililo, kabili ukulingana kwalinga ukwa BChl Qy ukwakulisha kwabomfiwe ku kupenda. Ukuloba kwa RC-LH114-W ukwapimilwe pa 878 nm ni 3280±140 mM-1 cm-1, elyo ukuloba kwa RC-LH116 ukwapimilwe pa 880 nm ni 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 yalipiminwe ukulingana ne nshila mu (52). Mu kucefyako, ukubweluluka kwa ciputulwa ca HPLC (RP-HPLC) kwacitilwe ukubomfya inshila ya HPLC iya Agilent 1200. Ukusungulula mupepi na 0.02 nmol iya RC-LH116 nangu RC-LH114-W mu 50μl iya 50:50 methanol: chloroform iyakwata 0.02% (w/v) iya ferric chloride, no kusonkela umulopa wa ferric uwalinga kale. 40°C mu HPLC icakusungusha (80:20 umukaka: 2-umukaka) pa cipimo ca ×25 cm. Ukubomba ukuwamya kwa musango umo mu cisungusho ca HPLC ku kuceeceeta ukuwamya kwa menshi pa 275 nm (UQ10), 450 nm (amafuta ya menshi) na 780 nm (BChl) pa ora limo. Iciputulwa ca pa muulu ica 275 nm pa maminiti 25.5 calisangilwe, icali icabulamo ifintu fimbi ifyasangwa. Icifulo icabikwa pamo cibomfiwa ku kupenda umutengo wa molar uwa UQ10 uwafumishiwapo ukulingana ne cipimo ca kupima icapendelwe ukufuma ku kusonkela kwa fipimo fya busaka ukufuma kuli 0 ukufika kuli 5.8 nmol (Icikope S14). Cila cilangililo capitulwikwemo mu fiputulwa fitatu, kabili ububifi bwalandwapo bwalingana na SD iyalinga.
Iciputulwa ca RC-LH1 icakwata umusango wa Qy uwakulisha uwa 0.1 calipekanishiwe na 30 μM ukucefyako umutima wa ŋombe c2 (Merck, UK) na 0 ukufika kuli 50 μMUQ2 (Merck, UK). Ifyakumwenako fitatu ifya 1-ml fyalipekanishiwe pali cila UQ2 ukusansalikwa no kubikwa ubushiku bonse mu mfifi pa 4°C ukushininkisha ukuwamya kwakumanina ku mfifi ilyo bacili balepima. Ici ciputulwa ca nshita calipooselwe mu cipimo ca OLIS RSM1000 icakwata umulilo wa 300 nm / 500 uwa mishilwa, 1.24 mm iya kwingililamo, 0.12 mm iya pakati na 0.6 mm iya kufumamo. Iciputulwa ca 600 nm icakupitamo icalepa cibikwa pa mwinshi wa cilangililo ca cikope na cikope ca cilangililo icakufumyapo ulubuuto lwa kucincimusha. Ukusenda kwaceeceetelwe pa 550 nm ne nshita ya kulonganika iya 0.15 s. Ubushiku bwa kucincimusha bufuma ku 880 nm M880F2 LED (Ubushiku Ubwafumya Diode) (Ubushiku Ubwafumya Ubushiku) (Ubushiku Ubwafumya Ubushiku) (Ubushiku Ubwafumya Ubushiku) (Ubushiku Ubwafumya Ubushiku) (Ubushiku Ubwafumya Ubushiku) (Ubushiku Ubwakufumya Ubushiku) ukupitila mu ntambo ya fibumba pa 90% ubukulu ukupitila mu DC2200 umukonshi (Ubushiku Ubwaku UK) kabili bufuma ku ntulo ya lubuuto pa 9°0. Umusango wa kupiminako walipusana ne cimonwa ku kubwesesha ulubuuto ululi lonse ulwashapokelelwe pa kutendeka ku cilangililo. Ukulolesha pa kusansalikwa 10 s ilyo ukumwentula kwa 50 s takulafika. Lyena ukunwa kwakonkelepo ukuceeceetelwa pa 60 s mu mfifi ku kupima ubukulu bwa quinolol mu kuitemenwa ukucefyako umubili wa c23 + (mona icikope S8 pa lwa fishinka ifipya).
Ilyashi lyabomfiwe ukupitila mu kulinganya umutande wa kubalilapo uwa mulongo mu kati ka 0.5 ukufika kuli 10 s (ukushintilila pa musango wa UQ2) no kupima imitantikile ya filangililo fyonse fitatu pali cila musango wa UQ2. Iciputulwa ca RC-LH1 icapendelwe ukupitila mu cipimo ca kupwisha icabomfiwe ku kwalula umutengo mu kufikapo kwa cipimo, icalembwa mu cipimo ca Pro 2019 (Icifulo ca kutendekelako, USA), kabili icalinga ku cilangililo ca Michaelis-Menten ku kwishiba imitantikile ya Km na Kcat.
Pa kupima ukunwa kwa pa kashita akanono, ica kumwenako ca RC-LH1 calipooselwe ukufika kuli ~ 2 μM mu cipe ca IMAC icakwata 50 mM umulopa wa sodium (Merck, USA) na 0.4 mM umulopa wa sodium (Merck, USA). Ascorbic acid ilabomfiwa nga umupeela wa ma electron aya lambo, kabili tert-butaclofen ilabomfiwa nga umupeela wa QB ku kushininkisha ukuti umupeela wa RC umukalamba atwalilila ukucepa (ekutiila, tekuti abe uwacepa) mu nshita yonse iya kupima. Mupepi na 3 ml iya cilangililo ilalundwako ku cipimo ca kutendekelako ica kutendekelako (mupepi na 0.1 m mu butali, 350 RPM) ne 2 mm ubutali bwa nshila ya menso ku kushininkisha ukuti ica kumwenako mu nshila ya laser cili ne nshita iyalinga iya kwampana kwa mfifi pakati ka fipuupu fya kucincimusha. Ukubomfya ~ 100-fs amapulse ya laser ku kucincimusha Ti: Inshila ya laser iya safiro (Ifyakupangapanga ifyakupangapanga, USA) ukusansamusha icakumwenako pa 880 nm pa cipimo ca kubwelelamo ica 1 kHz (20 nJ ku NIR nangu 100 nJ ku Vis). Ilyo tamulalonganika amashiwi, lembeni ica kumwenako ku lubuuto lwa kucincimusha pa maminiti nalimo 30. Ukusokolola kukalenga QA ukukanabomba (nalimo ukucefyako QA umuku umo nangu ibili). Lelo mukwai ishibeni ukuti iyi nshila kuti yabweluluka pantu pa numa ya nshita itali iya kuitemenwa, RC ikabwelela panono panono ku mulimo wa QA. Icipimilo ca misango ya Helios (Imibombele iyayanguka nga nshi, USA) cabomfiwe ku kupima imisango ya misango iyapitapo ne nshita iyacelwa iya -10 ukufika kuli 7000 ps. Bomfyeni programu wa pa muulu (Imibombele iyayanguka, USA) ku kufumyapo ifipekanyo fya mashiwi, lyena ukubika pamo no kufilinganya. Bomfyeni ubupe bwa CarpetView (Ukwalula kwa Lubuuto Ltd., Lithuania) ukubomfya amashiwi ayasangwa pamo pakuti mukwate imisango yalekanalekana iyapalana no kubola, nangu bomfyeni umulimo uusanshamo ifilangililo ifingi ne fyasuko fya cibombelo pakuti filingane no kwaluka kwa misango imo iya misango mu Kutendeka (USALa).
Nga fintu tulandilepo pa muulu (53), filimu ya fyakupangapanga iyakwata LH1 iyabula fyonse fibili RC na antena ya LH2 iya ku nse yalipekanishiwe. Iciputulwa ca nshita calipooselwe mu 20 mM tris (pH 8.0) kabili lyene cabikwe mu cipe ca mabwe ayakwata inshila ya menso iya 2 mm. Iciputulwa ca nshita ica 30nJ cabomfiwe ku kucincimusha ica kumwenako pa 540 nm ne nshita ya kucelwa iya -10 ukufika kuli 7000 ps. Ukubomfya amashiwi ayatantikwa nga fintu yalondolwelwe ku Rps. icilangililo ca pal.
Iciputulwa ca nshita calipokelelwe ukupitila mu kusansalikwa pa maawala yabili pa 4°C, kabili lyene ukunwa kwa ciko pa 880 nm kwabweshiwe mu 20 mM tris-HCl (pH 8.0) na 200 mM NaCl. Ukusungulula umubili pa kufimba panono panono mu 2% (w / v) β-DDM pa ora limo mu mfifi pa 4 ° C. Icilangililo calipooselwe mu 100 mM (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) ukufika ku cipimo ca maprotini ica 2.5 mg ml-1 (ukufwailisha kwa Bio-Rad). Ukukonkanyapo ukubomba kwacitilwe ukufuma ku nshila yapulintwa kale (54), ukutendeka no kucefyako amaproteini 50 μg ukufika ku cipimo ca 50 μl ica TEAB icakwata 1% (w / v) umulopa wa sodium (Merck, UK). Pa numa ya kufwailisha pa maminiti 60, cacefiwe na 5 mM pa 37 ° C pa maminiti 30. Pa kupanga umulopa, pongoleni icilangililo na 10 mM umulopa wa S-methyomethanol sulfonate (Merck, UK) no kuubikako ukufuma ku 200 mM umulopa wa mulopa pa maminiti 10 pa kukaba kwa muputule. Ukugaya ifya kulya ifya kulya kwacitilwe ukupitila mu kulundako 2 μg iya musango wa kulya uwa Lys-C (Promega UK) no kufibika pa 37°C pa maawala yatatu. Iciputulwa ca nshita ica laurete cafuminemo ukupitila mu kulundako 50 μl iya ethyl acetate na 10 μl 10% (v / v) umusango wa LC uwa asidi wa trifluoroacetic (TFA; Ukulekanalekana kwa fiputulwa kwatungililwe ukupitila mu kusansalikwa pa 15,700 RCF pa maminiti 5. Ukulingana na mafunde ya bapanga, umutuntulu wa C18 (uwa sayansi uwa UK) wabomfiwe ku kufwaya no kufumya umucele mu ciputulwa ca panshi icali ne peptide. Pa numa ya kuuma ukupitila mu kufwailisha kwa muputule, ica kumwenako calisungululwe mu 0.5% TFA na 3% umukaka, kabili 500 ng yapitulwikwemo ukupitila mu kufwailisha kwa RP ukwabikwa pamo no kufwailisha kwa misango ukubomfya imitantikile ya mibombele iyalondolwelwe kale.
Bomfyeni ubukulu bwa fipendo (56) ku kusanga amaproteini no kupima ubukulu bwa kufwaya Rps. ifyakupangapanga ifyakupangapanga ifyakupangapanga (www. Amashiwi ya misango ya fimenwa fyabikwa mu cilonganino ca fimenwa ukupitila mu cifulo ca fimenwa ifya PRIDE (http.
Pakupitulukamo na RPLC ukubikwa pamo na ukufwailisha kwa misango ya misango, umusango wa RC-LH1 walipekanishiwe ukufuma ku misango ya Rps iya mu mpanga. Ukubomfya inshila yapulintwa kale (16), ukusansa kwa maprotini ukwapangwa mu maselo ya palustris kwali 2 mg ml-1 mu 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl na 0.03% (w / v) β- (ukufwailisha kwa Bio-Rad) ) DDM. Ukulingana na mafunde ya bapanga, bomfyeni icipe ca kusangulula ica 2D (GE Healthcare, USA) ku kufumyapo amaproteini 10 μg ukupitila mu nshila ya kupongolwela, no kusungulula umulopa mu 20 μl 60% (v / v) asidi wa formic (FA), 20% (v / v) Acetonitrile na 20% (v) water. Amalita yasano yapitulwikwemo na RPLC (Dionex RSLC) ukubikwa pamo no kupima ubukulu bwa fipe (UHR-TOF, Bruker). Ukubomfya umulongo wa MabPac 1.2 × 100 mm (Uwasambilila ifya sayansi, UK) ku kupaatulako pa 60°C na 100 μlmin -1, ne cipimo ca 85% (v / v) ica kusungusha A Ukubomfya intuntuko ya kupanga amafuta ya mulilo ayalinga ne fipimo fya kubalilapo ukucila pa maminiti 60, umusango wa kupima ubukulu bwa mubili upokelela 100 ukufika kuli 2750 m / z (umusango wa bukulu-ku-mutengo). Ukupitila mu kwafwilisha kwa cibombelo ca ExPASy ica kusanga ifya kupangapanga (FindPept), lembeni ubukulu bwa misango ku fiputulwa ifinono ifya cifulo.
Ama cell yakulile pa maawala 72 mwi samba lya 100 ml NF-iyacepako (10μm-2 s-1), iyalinga (30μm-2 s-1) nelyo iyakulisha (300μm-2 s-1) iya lubuuto. M22 umupaka (M22 umupaka umo umulopa wa menshi uwafuminemo kabili umulopa wa menshi uwabikwa pa cifulo ca menshi) mu cipe ca 100 ml ica pa muulu ica kufimbapo (23). Mu mipepele isano iya ma 30, amabuula ya magalasi aya ma micron 0.1 yalibikwe pa cipimo ca 1:1 ku kusenda ama cell no kutonta pali ice pa maminiti 5. Icintu icishingasunguluka, ama cell ayashiputuka ne mipeto ya gilasi fyafuminepo ukupitila mu kufimba pa 16,000 RCF pa maminiti 10 mu cipe ca pa muulu ica pa cipuna. 100,000 RCF mu 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ne 40/15% (w / w) ukusansa kwa sucrose pa maawala 10.
Nga fintu calondolwelwe mu mulimo wesu uwapita, ukucingililwa kwa cishibilo cakwe pa PufW (16). Mukucefyako, umutuntulu uwasanguluka (11.8 nM) nangu umuputule uuli no musango umo wine uwa RC (uwaishibikwa ukupitila mu kufumyapo ukucefyako ubupusano bwa misango no kulinganya umutolo pa gel iyafiita) mu 2x SDS ukubika umutolo (Merck, UK) ukusansalikwa imiku ibili. Amaproteini yalipaatulwe pa cilangililo ca 12% ica gel iya NuPage (Iya basambilila ifya sayansi, UK). Icipe ca gel calipooselwe ne buluu iyabuuta (Bio-Rad, UK) ukubika no kumona iciputulwa ca RC-L. Ama protein aya pa gel ya bubili yasendelwe ku cipe icabomfiwa na methanol (PVDF) ku kupima ubulwele bwa ku mubili. Iciputulwa ca PVDF calicililwe mu 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Pakati ka 20 na 5% (w / v) umukaka uwakunkumuka, kabili lyene ukubikwa mu cipe ca kucingililamo umukaka uwa kubalilapo (mu buffer 1:1000 A190-114A, Amalabu ya Bethyl, U.S.A.) pa maawala 4. Pa numa ya kusamba imiku itatu pa maminiti 5 mu cipe ca kucingililamo umubili, umubili walibikwe pamo ne cipe ca kucingililamo umubili ica bubili (icasansalikwa 1:10,000 mu cipe ca kucingililamo umubili) (Ifyakupangapanga, Italy) na Icikope ca Amersham 600 (Ubusaka bwa GE, UK).
Ukupitila mu kupanga ukwakanishiwa kwa maka ukwa cila gel iyafiita nangu umusebo wa kupiminako, ukubikako icifulo pe samba lya cipimo no kupenda ubukulu bwa RC-L (ifyakupiminako) na Protein-W (ifyakupiminako), mu cikopeJ (57) Ukubomfya icikope. Iyi imilinganine yapilibulwe mu milinganine ya molar ukupitila mu kutontonkanya ukuti imilinganine ya RC-L ku mapulotini-W mu cilangililo ca RC-LH114-W ica busaka yali 1:1 no kulungika amashiwi yonse ukulingana na ifyo.
Pa lwa fishinka fyalundwapo ifya muli ici cipande, mukwai moneni pa Intaneti.
Ici cipande ca kwingilamo icaisulwa icasalanganishiwa pe samba lya mafunde ya Laisensi ya Kupanga Ifyakupangapanga. Icipande cisuminisha ukubomfya ukwabula ukukanshiwa, ukusabankanya, no kupanga cipya cipya mu nshila iili yonse nga ca kuti umulimo wa kubalilapo walilumbulwa bwino.
Ishiba: Tulemulomba fye ukulemba akeyala kenu aka email pakuti umuntu uo mulepandako amano kwi buula aishibe ukuti mulefwaya ukuti amone email kabili te spam. Tatukakwate amakeyala ya email ayali yonse.
Ici cipusho cibomfiwa ku kwesha nga uli mutandashi no kucingilila ukutuma kwa spam ukwaibela.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M.
Umusango wa pamulu uwa cishiba ca lubuuto 1 icakosa mu kati ka fyasuko cipeela ukwishiba ukupya mu mibele ya quinone.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M.
Umusango wa pamulu uwa cishiba ca lubuuto 1 icakosa mu kati ka fyasuko cipeela ukwishiba ukupya mu mibele ya quinone.
©2021 Ibumba lya ku America ilya Kutungulula Sayansi. insambu shonse shasuminishiwa. AAAS ni cibusa wa kwa Hinari, Agora, Oare, KORA, CLOCKSS, Ukukonkana no Kupenda. Ukutunguluka kwa Sayansi 2375-2548.